肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin，BoNT) 是由肉毒梭 菌分泌的毒性最强的蛋白质，引起人中毒的主要为A 型，可 用于生物武器。近年来，肉毒中毒在世界各地时有发生，特别 是“9·11”事件之后，肉毒毒素成为各国生物反恐的重要内 容。建立一种快速、灵敏、可靠的肉毒梭菌检测方法，对于生 物防护和食品安全具有重要意义^〔1〕。目前，肉毒梭菌的常规 检测方法主要包括毒素蛋白检测和PCR 基因检测等 ^{〔2, 3〕}。 本研究以A 型肉毒神经毒素基因(botulinum neurotoxin type A，atx) 为靶基因，建立一种灵敏度高、特异性强、快速准确检 测肉毒梭菌的TaqMan 探针荧光定量PCR 方法。

伤寒沙门菌(H901 50097) 由北京军事医学科 学院惠赠; 变形杆菌(49027) 由北京药检所惠赠; 金黄色葡萄 球菌(ATCC6538) 、肠出血型大肠埃希菌O157: H7 2 株(883、 88236) 和DH5ɑ 由本系保存; 肉毒梭菌阳性模板人工合成。

pUC57(Amp + ) 载体克隆系统(美国Promage 公司) ; 质粒小提试剂盒(北京天根生化科技有限公司) ; Premix Ex Taq^TM (Perfect Real Time) 、DNA marker、Taq Master 酶(大连TaKaRa 公司) ; Tirs-乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic， EDTA，简称TE) 溶液、Luria-Bertani 培养基 (LB) 等自行配制。

蛋白核酸检测仪(美国GE 公司) ; PCR 仪(德 国Tgradient 公司) ; 凝胶成像分析系统(英国UVItec 公司) ; Mx3005P 实时荧光定量PCR 仪(美国Stratagene 公司) ; 生物 安全柜(新加坡ESCO 公司) 等。

根据Sebaihia 等^〔4〕公布 的A 型肉毒梭菌神经毒素基因atx 序列(GenBank No: CBO0806) ，利用DNAMAN 软件进行同源性分析，Primer Express 3.0 软件设计PCR 引物和TaqMan 探针，引物atx1 序列 为5'-ATGGTTATGGCTCTACTCAATACATTAG-3'，引物 atx2 序列为5'-CACCTAAAAGAGGATTTGTATCAACTTC- 3'，TaqMan 探针序列为5'-TGACTCCTCAAAACCAAATGTAAAATCTGGGCT- 3'，探针5' 端标记羧基荧光素(carboxy fluorescein，FAM) ，3 ' 端标记淬灭基团(Black hole quencher， BHQ) 。引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。

A 型肉毒梭菌为严格管控菌 种，本文根据GenBank 上的atx 基因序列，人工合成目的片 段，作为后续实验的模板。对模板进行PCR 扩增，连接到 pUC57(Amp + ) 载体，制备重组质粒，转化DH5ɑ 感受态细胞 增殖培养，抽提回收，测定重组质粒浓度和纯度，PCR 鉴定。

利用构建的pUC57 重组质粒作为肉 毒梭菌定量标准品，根据测定的质粒浓度对标准品进行10 倍 梯度稀释。优化的反应体系为Taq 酶10.0 μL、上下游引物 和探针各0.5 μL、ROX reference dyeⅡ 0.5 μL、DNA 模板 1.0 μL、去离子水7.0 μL，共20.0 μL。反应程序: 95 ℃预变 性30 s，以95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，扩增40 个循环，反应时间约1 h。利用优化的反应条件检测各梯度标准品的Ct 值，建立质 粒拷贝数与其对应关系的定量标准曲线。

将已知拷贝数的重组 质粒用TE 溶液进行10 倍梯度极限稀释，对各稀释浓度的模 板同时进行普通PCR 和荧光定量PCR 检测，比较2 种方法对 靶基因片段的最低检出限。

采用菌落PCR 方 法^〔5〕，以人工模拟的细菌混合液为食品污染样品，验证该法 检测atx 基因的特异性。实验以含重组质粒的样品作为阳性 品，以5 株食源性细菌作为阴性对照菌株，以上述细菌的混合 液作为污染的模拟样品，以去离子水作为无模板空白对照 (no template control，NTC) 。反应程序: 95 ℃预变性5 min， 以95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，扩增35 个循环，反应时间约 90 min。

以拷贝数为2.2 × 10⁵ 的重 组质粒作为检测模板，利用同一实验条件检测分装的15 份平 行样品的Ct 值变异系数(标准差/重复样品的算术均数) 来 初步评估该方法的重复性。

图 1

注: M: DL500 DNA marker; 1: 扩增的目的片段(96bp) ; 2: 无模 板空白对照。 图 1 肉毒神经毒素atx 基因扩增片段鉴定

实验测得抽提的重组质 粒浓度为66.54 ng /μL，OD260 /280 为1.868，说明该重组质 粒的纯度较高。根据阿伏伽德罗常数计算重组质粒的拷贝数 为2.2 × 10¹⁰ copies /μL。取稀释的重组质粒作为模板，进行 PCR 扩增，3 % 琼脂糖凝胶电泳鉴定。在100 bp 处可见一明 亮条带，扩增产物大小为96 bp。

利用优化好的反应体系对5 个10 倍梯度稀释的定量标准品进行检测，标准曲线在2.2 × 10³ ～ 2.2 × 10⁷ 拷贝数之间有较好的线性关系，相关系数为 0.997，扩增效率为101.1%，得到标准品拷贝数与Ct 值的线 性方程为: Ct = － 3.296 × LOG(copies) + 42.69。对样品进行 检测时，根据其Ct 值和线性方程就可获得该样品DNA 拷 贝数。

图 2

注: M: DL500DNA marker; NTC: 无模板空白对照; 106 ～ 100 : 各 样品质粒浓度拷贝数。 图 2 肉毒梭菌PCR 极限浓度检测

将已知拷贝数的重 组质粒进行10 倍梯度极限稀释，对2.2 × 10⁶ ～ 2.2 × 10⁰ 拷贝 数样品进行荧光定量PCR 和普通PCR 检测。实验结果可 知，荧光定量PCR 最低可检测到2.2 × 10¹ 个拷贝数; 而普通 PCR 检测中，当质粒浓度为103 拷贝数时，可见一微弱条带， 表明普通PCR 的最低检出限约为2.2 × 10³ 个拷贝数。

表 1

表 1 肉毒梭菌特异性检测结果

表 1 肉毒梭菌特异性检测结果

利用本实验建立的 肉毒梭菌荧光定量PCR 检测方法对肉毒梭菌标准品和5 株 食源性细菌进行检测，只有含atx 基因扩增片段的4 个样品 出现典型的扩增曲线，为阳性结果; 而其他食源性细菌和空白 对照均为一平直线，Ct 值无法读取，判为阴性。结果与普通 PCR 检测完全一致。

为评估该检测方法的重复 性，本研究对同一浓度模板的15 个样品进行检测，并统计获得 的Ct 值。结果显示，15 个样品的Ct 值读数范围为25.51 ～ 26.65，标准差为0.27，变异系数为1.0%。表明本实验建立的 肉毒梭菌荧光定量PCR 检测方法重复性较好，可对A 型肉毒 梭菌样品进行稳定、可靠的检测。

肉毒梭菌具有极强的神经毒性，被列为重要的生物战剂， 一般很难得到该菌样品。随着基因工程技术的发展，免疫 PCR^〔3〕、分子信标PCR^〔6〕、荧光定量PCR^〔7〕等分子克隆技术 在病原微生物领域广泛应用，使得人工合成基因序列检测重 要管控病原微生物成为可能。本文通过合成肉毒梭菌毒素基 因序列，作为检测的模拟阳性样品，建立荧光定量PCR 快速 检测方法，用于高度危险、不易获得的病原微生物检测。

研究结果显示，荧光定量PCR 检测灵敏度达到22 个 DNA 拷贝数，与Fach 等^〔8〕的实验结果基本一致，比普通PCR 提高了100 倍，可用于微量污染样品的检测。实验检测含肉 毒毒素基因样品均呈阳性，其他菌株均为阴性，表明本方法对 肉毒梭菌有较高的检测特异性，而且可重复性好，能保证对样 品进行稳定、可靠的检测。同时该技术自动化程度高，封闭环 境，无后处理，保障了实验人员的安全，适合于临床大规模快 速检测。结合菌落PCR 技术简化了细菌基因组提取的繁琐 步骤，比传统检测方法大大缩短了检出时间。

与传统的肉毒梭菌检测方法相比，本研究建立的荧光定 量PCR 检测方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、省时省 力等特点，为肉毒梭菌检测和流行病学调查提供了有力工具， 适用于肉毒中毒高发区进出口物品检验检疫、食品安全检测、 致病菌临床诊断及生物安全防护等领域，应用前景广阔。