中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (6): 823-825   PDF    
引用本文
赵晓南, 李鸿钧, 吴晋元, 张光明, 易山, 杨星, 郜岩, 贾琴妹, 木国法, 孙茂盛. 秋冬季婴幼儿轮状病毒感染分子流行病学调查[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(6): 823-825.
ZHAO Xiao-nan, LI Hong-jun, WU Jin-yuan, et al. Molecular epidemiologic distribution of rotavirus infection in autumn and winter among infants in Zhaotong area of Yunnan province, 2010[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(6): 823-825.
秋冬季婴幼儿轮状病毒感染分子流行病学调查
赵晓南1, 李鸿钧1, 吴晋元1, 张光明1, 易山1, 杨星1, 郜岩2, 贾琴妹1, 木国法3, 孙茂盛1     
1. 北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室, 云南昆明650118;
2. 昆明医学院;
3. 云南省昭通市第一人民医院
收稿日期: 2011-08-29.
基金项目: 云南省社会发展科技计划国际合作项目(2008CA028);云南省应用基础研究计划面上项目(2009CD142)
作者简介: 赵晓南(1986- ),男,云南昆明人,硕士在读,研究方向:分子生物学与生物化学。
通讯作者: 孙茂盛,E-mail:maoshs@imbcams.com.cn
摘要: 目的 监测2010年云南昭通地区秋冬季腹泻患儿感染轮状病毒的流行趋势,了解流行毒株的基因型特征。方法 2010年9—12月在云南省昭通市第一人民医院采集94份就诊的腹泻患儿粪便,应用胶体金法、逆转录聚合酶链式反应及PAGE电泳等方法,对样品进行轮状病毒抗原检测,其中8份阳性样品进行VP7基因测序分析及基因型分型。结果 腹泻病患排泄物中轮状病毒抗原阳性比例为54.3%(51/94);8份轮状病毒基因序列分析,其中7份为G1型,1份为G3型;核苷酸同源性分析发现检测样品中轮状病毒主要与在中国辽宁、印度和泰国发现的流行株相似。结论 2010年昭通地区秋冬季患儿腹泻主要由轮状病毒引起,其中以G1型为主,其次为G3型。
关键词: 轮状病毒     婴幼儿     腹泻     基因型    
Molecular epidemiologic distribution of rotavirus infection in autumn and winter among infants in Zhaotong area of Yunnan province, 2010
ZHAO Xiao-nan, LI Hong-jun, WU Jin-yuan, et al    
Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases.Institute of Medical Biology, Peking Union Medical College, Kunming City, Yunnan Province, Kunming 650118, China
Abstract: Objective To investigate etiology,epidemiologic and molecular virology features of rotavirus causing infant diarrhea in Zhaotong region in autumn and winter of 2010.Methods A total of 94 pieces of stool specimen collected from infants with acute diarrhea in the First People's Hospital of Zhaotong City from September to December,2010 were analyzed with colloidal gold test,reverse transcription-PCR,and polyacylamide gel electrophoresis and then 8 stool specimens were selected from the 94 specimens and analyzed by VP7 gene sequencing and genotyping.Results Rotaviruses were detected in 54.3% of samples.Rotavirus genome sequence analyses showed 7 samples were G1 and one sample was G3.Phylogenetic analysis based on nucleotide sequence revealed that the rotavirus isolated in Liaoning province,India and Thailand were very similar strains.Conclusion The infant diarrhea epidemic in the autumn and winter of 2010 in Zhaotong area was mainly caused by G1 and G3 genotype rotavirus.
Key words: rotavirus     infant     diarrhea     genotype    

轮状病毒(rotavirus,RV)是引起婴幼儿严重腹泻的主要原因之一〔1〕,全世界几乎每一位≥5岁的儿童都被感染过至少1次〔2〕。据世界卫生组织报道,每年约有527 000个婴幼儿死于轮状病毒感染〔1〕。轮状病毒的感染监测是预防和治疗RV引起腹泻的重要环节。中国在测轮状病毒流行趋势方面做了许多工作,各大城市均有哨点医院监测报道〔3, 4, 5〕。 为了解轮状病毒的基本流行趋势,本研究分析了云南昭通市医院采集的94份腹泻患儿粪便样品,明确其感染状况及基因型分布,并根据VP7基因核苷酸序列构建了进化系统树。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

2010年9月3日-12月10日,在云南省昭通市第一人民医院采集就诊的≤2岁腹泻患儿粪便样品共94份,其中男性患儿样品61份,女性患儿样品33份。粪便均为就诊化验时采集,编号,冷藏送至医学生物学研究所,-20℃冷藏备用。

1.2 主要仪器与试剂

A群轮状病毒诊断试剂盒(胶体金法)(北京万泰生物药物股份有限公司);MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0病毒基因组RNA提取试剂盒、PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒、 DL2000 DNA Marker[宝生物工程(大连)有限公司]。凝胶成像仪(美国GE公司);DNA测序仪3730XL (美国ABI公司)。

1.3 方法 1.3.1 样品处理

粪便样品按1:5(w/v)比例用pH 7.2磷酸盐缓冲溶液稀释,充分搅匀后经3 000 r/min,15 min离心取上清,分装于1.5 mL离心管中备用。

1.3.2 胶体金法

使用时严格按试剂说明书操作。吸取80 μL粪便上清样滴于检测孔中,10 min内观察检测结果。检测区若出现2条红带记为阳性,仅出现对照条带记为阴性。

1.3.3 病毒基因组RNA提取

使用MiniBEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver.4.0病毒基因组RNA提取试剂盒,操作步骤严格按照说明书。

1.3.4 逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)

VP7、VP4和NSP4全基因片段由特异引物扩增〔6, 7〕。VP7基因扩增引物为:Beg9,5 '-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG- 3';End9,5'-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG- 3';产物大小为1 062 bp。VP4基因扩增引物为:VP4 F,5'-GGGTATAAAATGGCTTCGCTCATTT- 3';VP4 R,5'-GGTCACATCCTCGATGAGTTTCTCA- 3';扩增产物大小2 359 bp。NSP4基因扩增引物为:NSP4 Beg,5'-TAAAAGTTCTGTTCCGAGAG-3';NSP4 End,5'- GATTGGTTAAACGGGATTA-3';扩增产物大小698 bp。反应体系为50 μL,PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL,2 × 1 Step Buffer 25 μL,引物1 μL,RNA模板5 μL,RNase Free dH2O补足至50 μL。反应条件设置为:(1)50℃ 30 min;(2)94℃ 2 min;(3)94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 1 min,30次循环;(4)72℃ 10 min。扩增反应分为2组,第1组使用VP7及 VP4引物,第2组使用NSP4引物。

1.3.5 病毒基因组聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacylamide gel electrophoresis,PAGE)

病毒基因组RNA经聚丙烯酰胺凝胶90 V连续电泳9 h,硝酸银染色〔8〕。

1.3.6 RT-PCR产物电泳分析

及序列测定产物在1.0% (w/v)琼脂糖凝胶(Tris硼酸缓冲液)中90 V电泳1 h。溴化乙锭染色,凝胶成像仪下记录图像。PCR产物纯化后测序,测序引物为上述RT-PCR对应引物。

1.3.7 核苷酸序列系统发育分析

8份阳性粪便样品RV病毒组VP7基因测序,进行基因核苷酸序列同源性分析,使用 MEGA 4软件构建进化树。

2 结 果 2.1 轮状病毒检测结果(表 1)
表 1 不同性别、年龄患儿粪便样RV感染情况

94份样品中,RV阳性率为 54.3%(51/94)。RV阳性率在不同性别、不同年龄间差异均无统计学意义。从2010年9月3日开始,以周为单位记录粪便样品RV的阳性率,结果显示RV的感染高峰出现在10月中旬之后,并维持了8周左右的高感染率时期。

2.2 RT-PCR产物凝胶电泳(图 1、2)
注:M:DL2000 DNA Marker;0:RT-PCR阴性对照;50~80:粪便样品编号。 图 1 VP7和VP4基因RT-PCR产物部分电泳图

注:M:DL2000 DNA Marker;51~89:粪便样品编号。 图 2 NSP4基因RT-PCR产物部分电泳图

对94份腹泻样本提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法进行RV检测,共检测出38份RV阳性样品(阳性率40.4%,38/94)。其中,用VP7 引物共扩增出37份样品的VP7全基因片段,VP4基因共扩增出21份,NSP4基因共检测出24份。

2.3 病毒基因组RNA PAGE电泳(图 3)
注:Marker:DL2000 DNA Marker;①~⑨:22T,38T,45T,51T,63T,68T,79T和94T,30T;1-11:轮状病毒11个基因片段。 图 3 部分病毒基因组RNA PAGE电泳图谱图4轮状病毒VP7基因序列对比同源性分析系统进化树

提取94份粪便样品的病毒基因组RNA,PAGE电泳后进行电泳图谱分析。 PAGE电泳共检测出17份RV阳性样品(阳性率18.1%,17/94)。所有出现条带的样品均为典型的轮状病毒带型:4- 2-3-2。根据PAGE电泳结果,从中挑选了8份粪便样品扩增 VP7基因片段并测序。

2.4 VP7基因核苷酸序列进化关系分析(图 4)
图 4 轮状病毒VP7基因序列对比同源性分析系统进化树

从Gen- Bank中选取了的典型人RV (Wa、KUN、AU-1、Hochi、Odelia、 KO-2、DS-1、AU32、ITO等)、典型动物RV (SA11、Gottfried)、 中国其他地区流行株(DL8、PJ12、SY5)、印度流行株(mani- 140/06,mani-63/06,mani-365/07)、泰国流行株(Thai-2104,Thai-1604,Thai-804、CMH222等)以及部分从日本、越南、美国、古巴等国分离的RV流行株,与8份样品VP7基因测序核苷酸序列对比。结果显示,8份样品鉴定出7份G1型RV (22T、38T、45T、51T、68T、79T和94T),和1份G3型RV (30T)。其中,22T、45T和94T与在印度分离的mani-140/ 06、mani-63/06、mani-365/07、泰国分离的Thai-2104的核苷酸同源性较高。51T、79T、68T与分离自中国辽宁的DL8株同源性较高。38T与另一株分离自中国辽宁的SY5同源性高。 30T则与泰国流行株CMH054同源性最高。

3 讨 论

本研究通过对3种检测方法的比较,发现胶体金方法的检出率最高,其次是RT-PCR检测法,PAGE方法的检出率较低。表明胶体金法检测粪便样品仍是最敏感的方法之一。与胶体金方法相比,PAGE电泳条带分析的优点在于,可以初步判断样品中RV含量及其分型,但使用条件受样品中病毒浓度的限制。而RT-PCR的方法,主要用于G、P型分型〔9〕,较为灵敏,但结果受反应条件和引物设计的影响较大。

以往报道显示,中国RV腹泻以秋冬季为流行高峰〔3, 10〕,主要流行时间从每年10月至次年2月。总体上流行株以G1 血清型为主,2001年以后则以G3型为主〔3〕。本研究监测结果显示,轮状病毒的流行感染与患儿的性别和年龄差异无关,而与季节因素影响为主,流行时间分布与此前报道结论一致。 测序鉴定表明,以G1型为主,G3型为辅的A群轮状病毒是昭通地区婴幼儿由轮状病毒感染引起的腹泻的主要原因。该结论与以往G3型为主的监测结果存在差异,可能由局部的地域性导致。7份G1型的样本VP7基因序列之间存在一定差异,提示有多个亲代来源的G1型轮状病毒在当地流行。 此外,粪便样品中RV与此前在国内和亚洲其他地区的流行株相似,提示采样地的RV流行株与在亚洲区域流行的RV 流行株具有较高的相似性。及时准确的了解轮状病毒的流行趋势,对积极治疗和研发RV疫苗,具有重要的指导意义。

参考文献
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