Hedgehog (HH)信号通路在组织修复与损伤中可以促使正常干细胞进行自我更新,最近研究认为,HH信号通路是白血病干细胞所必需的功能性通路,如这一通路失活,将可阻碍白血病进展^〔1〕。Gli是HH信号通路的最后效应阶段,研究表明Gli不仅受HH/Smo信号调控,也受转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)信号转导通路调控,这种调控是独立于Ptch/Smo途径的^〔2〕。本研究通过观察TGF- β对KG-1细胞Gli 2表达影响,探讨白血病中TGF-β信号通路对Gli的调控,寻找白血病治疗新靶点。

KG-1细胞(中国医学科学院血液研究所)。细胞采用含20%胎牛血清的IMDM培养基,5 % CO₂、 37℃环境培养。

重组人细胞因子TGF-β 1(美国Pepro Tech公司);SIS 3(specific inhibitor of Smad 3)(德国Merck 公司);兔抗人Gli 2抗体(美国Santa Cruz公司);Real time RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司);Rotor-Gene 6000 实时定量PCR仪(德国QIAGEN公司);凝胶成像系统(美国 Syngene公司)。

细胞总RNA提取按照Trizol Reagent 说明书进行,应用20%琼脂糖凝胶电泳和分光光度仪对 RNA质量进行鉴定。

按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA 。反应体系如下:5 × RT buffer 2 μL,dNTP mixture (10 mmol/L)1 μL,random Hexamer primer 0.5 μL,RNase inhibitor ( 40 U/μL)0.5 μL,AMV reverse transcriptase 0.5 μL,实验样品RNA 1 μL,RNase Free H₂O 4.5 μL,于25℃静置10 min,45℃ 45 min,95℃ 5 min,4℃ 5 min。

反应体系及反应参数:采用SYBR Prem ix Ex Taq^TM Kit进行定量PCR,SYBR Primx Ex Taq 12.5 μL,PCR Forward Primer (10 μmol/L)0.5 μL,PCR reverse primer (10 μmol/L)0.5 μL,cDNA 2 μL,dH₂O 9.5 μL,总体积25 μL。反应条件如下:95℃ 1 min预变性1次,95℃ 10 s,60℃ 30 s,循环反应40次。待测样品每管重复3次。 PCR仪(德国QIAGEN公司)上进行。PCR引物序列,Gli 2 (sense5'-TGGCCGCTTCAGATGACAGATGTTG-3',anti sense 5'-CGTTAGCCGAATGTCAGCCGTGAAG-3'),ABL (sense 5'-CGAGAGCCTGGCCTACAACAA-3',anti sense 5'-CTAGCAGCTCATACACCTGGGACA- 3')。采用comparative Deltadelta Ct法计算Gli 2表达。

采用免疫蛋白印迹 (western blot)法,培养结束后,细胞1 000 r/min 4℃离心,用冰预冷磷酸盐缓冲液洗2次,加裂解液,于冰上裂解30 min,12 000 r/min 4℃离心30 min,将离心所得上清转入另一新EP 管中,-80℃保存备用。样本蛋白测定浓度后,加入上样缓冲液混匀,100℃变性5 min。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白(100 μg/道),然后转移到聚偏氟乙烯膜上,转膜完毕后,于三羟甲基胺基缓冲液 (TTBS)中浸泡5 min,用5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h。加入兔抗人Gli 2单克隆抗体(1:1 000稀释)或β-actin (1:500 稀释),4 ℃过夜。洗膜后加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG (1:5 000稀释),37℃孵育2 h。将增强化学发光试剂盒中A 液和B液等量混合,滴加于膜上,反应1 min后,在发光仪上发光。待测样品重复3次。

统计数据以SPSS 13.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,多个样本均数比较采用最小显著差法。P < 0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 TGF-β1 对KG-1 细胞Gli 2 的mRNA 表达影响

表 1 TGF-β1 对KG-1 细胞Gli 2 的mRNA 表达影响

与对照组比较,0.1 ng/mL TGF-β 1作用于KG-1细胞6、12、24 h后,Gli 2表达无明显变化;而1、10 ng/mL TGF-β 1分别作用于 KG-1细胞6、12和24 h后,Gli 2表达明显低于对照组,时间效应关系明显;1与10 ng/mL TGF-β 1组间无明显差异。

图 1

图 1 TGF-β、SIS3 对KG-1 细胞Gli 2 蛋白表达影响

Western blot结果显示,5 ng/mL TGF-β 1作用于KG-1细胞24 h后,Gli 2蛋白表达较对照组明显降低;5 ng/mL TGF-β 1+ 5 μmol/L SIS 3作用于KG-1细胞24 h后,其Gli 2蛋白表达较对照组明显增高。

研究表明HH通路与包括白血病在内的多种肿瘤性疾病相关,因此抑制该通路有可能成为肿瘤预防和治疗新靶点^〔1〕。Gli是HH信号通路的最后效应阶段,包括3个同源基因:Gli 1、Gli 2和Gli 3。Gli 2在不同细胞,不同时期可能分别起激活或抑制作用^〔3〕。Gli分子与肿瘤细胞发生和发展无直接关系,但直接调控肿瘤细胞增殖、分化、转移的分子基因转录水平则受到HH信号通路调控,可能是该通路导致肿瘤的关键因素。在造血系统中,HH家庭成员在体外和体内干/ 祖细胞扩增中起重要调节作用。类似于HH信号通路,TGF- β在血管生成、炎症、组织修复和调节细胞生长和分化等过程中发挥着重要作用^〔4〕。其中TGF-β 1生物活性最强,在造血调控方面起重要作用^〔5〕。最近研究表明TGF-β通路可以调控Gli功能^〔6〕。

研究表明在白血病细胞上存在HH信号转导通路中Ptch 和Smo分子缺失,而Gli则有表达^〔7〕,因此阻断Gli表达可能成为治疗急性白血病方法之一。本研究结果显示,1、10 ng/ mL TGF-β 1作用于KG-1细胞24 h内,Gli 2表达较对照组明显减少,且存在时间效应。TGF-β下游信号是Smad 2和 Smad 3,对于成人,Smad 3是TGF-β最主要依赖下游信号,而 Smad 2则在胚胎发育形成时起关键作用^〔8〕。因此,本研究应用SIS 3^〔9〕(特异性Smad 3阻断剂),阻断TGF-β作用,结果表明SIS 3可以有效阻断TGF-β引起的Gli 2表达降低。因为KG-1细胞不表达Ptch和Smo^〔7〕,所以TGF-β降低KG-1 细胞Gli 2表达,是不依赖于Ptch/Smo这一途径的,而依赖于 Smad 3途径。提示可以应用TGF-β,并通过Smad 3途径调控Gli 2基因,作用于下游与细胞增殖分化有关基因,进而对白血病起到治疗作用。