中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (6): 778-780   PDF    
引用本文
黄璜, 李军, 张卫东. 合并感染HIV对1b型HCV E2/NS1包膜区基因影响[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(6): 778-780.
HUANG Huang, LI Jun, ZHANG Wei-dong. Effects of HIV/HCV con-infection on E2/NS1 of HCV 1b genotype[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(6): 778-780.
合并感染HIV对1b型HCV E2/NS1包膜区基因影响
黄璜, 李军, 张卫东     
郑州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室, 河南郑州450001
收稿日期: 2012-02-07.
基金项目: 国家“十一五”科技重大专项(2008ZX10002-013)
作者简介: 黄璜(1986- ),女,河南济源人,硕士在读,研究方向:流行病学。
通讯作者: 张卫东,E-mail:imooni@163.com
摘要: 目的 研究人类免疫缺陷病毒(HIV)感染对1 b型丙型肝炎病毒(HCV)E2/NS1包膜区基因变异的影响,探讨2组间E2/NS1区基因序列同源性差异,为HCV/HIV合并感染者中HCV的治疗提供依据。方法 对河南省某有偿献血村进行随访,将得到的所有HCV阳性病例255例根据合并HIV感染的情况分成2组,并对其基因分型,然后进行逆转录(RT)-巢式PCR扩增1 b型HCV E2/NS1包膜区基因,继而进行单链构象多态性分析(SSCP)、纯化后测序。结果 HCV单纯感染组和HIV/HCV合并感染组SSCP平均条带数分别为(3.4±0.55)、(2.6±0.55)条,差异有统计学意义(t=2.32,P=0.049);HCV单纯感染组和HIV/HCV合并感染组HCV E2/NS1包膜区同源性分别为76.7%和87.6%,差异有统计学意义(χ2=20.13,P<0.001);2组第一高变区(HVR-1)同源性分别为59.3%和81.9%,差异有统计学意义(χ2=10.39,P=0.001);2组第3高变区(HVR-3)同源性分别为71.7%和83.9%,差异有统计学意义(χ2=4.60,P=0.03);单纯HCV组中变异性较高的氨基酸位点在HCV/HIV合并感染组中表现出较高的保守性。结论 HIV感染对1b型HCV E2/NS1包膜区基因变异具有抑制作用,且其主要体现在HVR-1和HVR-3区。
关键词: 丙型肝炎病毒     人类免疫缺陷病毒     逆转录聚合酶链反应     E2/NS1包膜区     基因变异    
Effects of HIV/HCV con-infection on E2/NS1 of HCV 1b genotype
HUANG Huang, LI Jun, ZHANG Wei-dong     
Department of Epidemiology and Health Statistics, College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
Abstract: Objective To study the change of E2/NS1 area of hepatctis C virus(HCV)caused by human immunodeficiency virus(HIV)/HCV co-infection and homologic differences between the two groups and to provide evidence for the treatment of HCV/HIV co-infection.Methods Totally 255 HCV positive cases were divided into two groups according to their HIV infection status and the HCV genotypes of the cases were identified.The E2/NS1 of HCV was amplified with reverse transcription-PCR(RT-PCR)for single strand conformation polymorphism(SSCP)analysis and sequenced after purification.Results There were statistical differences between the HCV/HIV co-infection group and the HCV mono-infection group in genotype of HCV(χ2=35.4,P < 0.001).There were statistical differences between the HCV/HIV co-infection group and the HCV mono-infection group in SSCP strip number(t=2.32,P=0.049).The homology of E2/NS1 of HCV for HCV mono-infection and HIV/HCV co-infection was 76.7% and 87.6%,respectively,with a significant difference (χ2=20.13,P < 0.001).The variation in the two groups comes from HVR-1,HVR-2,and HVR-3.The homologic differences of the two groups are HCV E2/NS1,HVR-1,and HVR-3.The amino acid sites have high mutation in HCV monoinfection group but are more conservative in the HCV/HIV co-infection group.Conclusion HCV 1b is the main genotype in HCV mono-infection and HIV/HCV co-infection groups,but there are significant differences in HCV genotype distribution between the two groups.HIV can reduce the gene variant of 1b HCV E2/NS1,mainly in HVR-1 and HVR-3 area.
Key words: HCV     HIV     RT-PCR     E2/NS1 envelope     gene variant    

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是当今世界性的公共卫生问题,因传播途径相同,常合并感染〔1〕。而HIV感染可改变机体的免疫状态,影响HCV E2/NS1包膜区基因序列及结构变化,进而可能改变慢性HCV感染进程〔2〕。为研究 HIV/HCV合并感染对包膜区基因的影响,为HIV/HCV合并感染中HCV的治疗提供依据,本研究于2009年8月对河南省王营村有有偿献血史的所有HCV阳性病例255例进行随访,采集血样,并根据是否合并HIV进行分组,进行分子生物学实验。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 血样来源

本课题组于2009年8月对河南省有偿献血村王营村进行随访,在2005年《河南省艾滋病综合防治项目》普查的基础上筛选该村HCV感染者和HIV/HCV合并感染者为调查对象,所有研究对象均在调查前签署知情同意书,由护士空腹采集其静脉血5ml,并对CD4+T细胞计数检测。 根据合并HIV感染情况的不同将全部随访的样本分为HCV/ HIV合并感染组106例和单纯HCV感染组149例,在符合条件的2组中随机抽取10例HCV基因分型为1b的感染者,组成HCV E2/NS1包膜区基因变异性研究的样本。HCV检测采用酶联免疫试剂盒(北京万泰生物药业有限公司),抗- HCV抗体阳性者诊断为HCV感染。HIV检测采用HIV 1+2 型抗体诊断试剂盒(北京金豪制药有限公司)。筛查阳性患者由护士再采5mL静脉血,分离血浆,用HIV1/2抗体诊断试剂盒(杭州澳亚生物技术有限公司)进行确认试验,确认阳性者诊断为HIV感染。所有检测均参照试剂盒说明书。

1.1.2 主要试剂与仪器

HCV巢式引物(上海博大生物有限责任公司);RNA酶抑制剂(北京Promega公司);病毒 DNA/RNA快速纯化试剂盒(大连TaKaRa宝生物工程有限公司)。台式水平离心机(德国Eppendorf公司);DYY-8C型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);基因凝胶成像系统(美国Syngene公司)。

1.2 方法 1.2.1 HCV基因分型

参照文献〔3, 4, 5〕提取血浆中病毒 RNA,PCR扩增HCV核心区特异性片段,根据Simmonds命名系统确定样本的基因分型,其中1a型(57 bp),1b型(144 bp),2 a型(174 bp),2 b型(123 bp),3 a型(98 bp)〔6, 7〕。

1.2.2 HCV E2/NS1

包膜区基因变异性由于是来自同一地区同一基因型的样本,且所有HCV感染者均未接受过干扰素治疗,故认为在符合条件下随机抽取每组中分型结果为 HCV 1b型的样本能够反映当地HCV 1b基因型E2/NS1包膜区基因的变异情况。对上述入选样本重新提取核酸RNA,继而进行逆转录,PCR,取第二次PCR产物作电泳和纯化,单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism,SSCP),对结果进行数据分析,应用DNAMAN和MEGA4.1 软件构建2组的系统发生树〔6, 7〕。

1.3 统计分析

应用SPSS 13.0软件进行t检验和χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结 果 2.1 基本情况

255例HCV患者中,男性119例,女性136 例;年龄为15~78岁,平均为(46.82 ± 5.36)岁。单纯HCV 感染组与HIV/HCV混合感染组的性别构成差异有统计学意义(χ2=4.72,P < 0.05)。

2.2 10株不同来源的HCV E2/NS1包膜区基因SSCP结果 (图 1)
注:1、9、10:3例接受抗HIV治疗者SSCP条带;4、5:2例未接受抗HIV 图 1 治疗者SSCP 条带; 2、3、6、7 、8: 5 例单纯HCV 感染者SSCP 条带。

在5例HCV/HIV的合并感染者条带数分别为3、2、 2、3、3,平均为(2.6 ± 0.55)条;5例单纯HCV组条带数分别为3、4、3、3、4,平均为(3.4 ± 0.55)条。单纯HCV感染组平均的SSCP的条带数多于HCV/HIV合并感染组的平均SSCP 的条带数,在HCV/HIV合并感染组中,2 例未经高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy,HARRT)治疗者的平均SSCP的条带数平均为3.0,而3例接受HARRT治疗者的平均SSCP的条带数平均为2.3,未接受HARRT治疗者的平均SSCP的条带数更接近单纯HCV感染组(t=2.32,P=0.049)。

2.3 2 组间HCV E2/NS1包膜区核苷酸序列比较(表 1)
表 1 2 组间HCV E2 /NS1 包膜区及各个 高变区组间同源性比较( %)

2 组组内核苷酸同源性较低的区域集中在高变区(hyper variant region,HVR) HVR-1、HVR-2、HVR-3,而2组间在HCV整个 E2/NS1包膜区核苷酸同源性差异有统计学意义(χ2=20.13,P < 0.001),在HVR-1(χ2=10.39,P=0.001),HVR-3(χ2= 4.60,P=0.03)2组间同源性差异也有统计学意义,而在 HVR-2及其他核苷酸区,2 组间核苷酸同源性差异无统计学意义(P > 0.05),提示组间差异主要来自于HVR-1、HVR-3。

2.4 2 组间HCV E2/NS1包膜区内HVR-1氨基酸序列比较

2组间HCV E2/NS1包膜区内的HVR-1区第2、6、23、24、 26、27位氨基酸位置全为保守序列,不同来源的HCV E2/ NS1包膜区在这些位置上完全一致;脯氨酸只出现在23位甘氨酸的两侧;第7位氨基酸中,5 例HCV/HIV合并感染者全部为甘氨酸,而在单纯HCV感染组中,编号为6、7、8的3例为甘氨酸,但编号为9、10的2例却为丙氨酸和谷氨酸,且为非同义突变;第25位的氨基酸在5例HCV/HIV合并感染者中高度保守为丝氨酸,而在5例单纯HCV感染者中却呈现高度变异,分别为2例脯氨酸,1 例丙氨酸,1例天冬酰胺,1例天冬氨酸,且均为非同义的变异;第12位氨基酸在5例 HCV/HIV合并感染者中高度保守为苏氨酸,但在5例单纯 HCV感染者中,只有2例为苏氨酸,其他3例中2例为丙氨酸、1例为丝氨酸,且均为非同义突变。

2.5 2 组间的系统发生树(图 2)
图 2 2 组间HCV E2 /NS1 包膜区系统发生树

2组间核苷酸、氨基酸变异性存在差异,为研究组间进化趋势是否会因为这些差异而不同,因此选择上述方法构建2组间的系统发生树。

3 讨 论 本研究结果文献〔8, 9〕结果一致,表明2组之间存在着基因的变异程度不同,HCV/HIV合并感染组基因位点的变异性较大,存在较少的点突变;在合并HIV感染但未接受 HARRT治疗的情况下,HIV能够降低HCV E2/NS1包膜区基因的变异性,但在接受HARRT治疗后,会增加这种趋势,与国外的研究结果一致〔10, 11, 12〕。

HVR-1具有多种生物学功能,其中最为重要的是抗 HVR-1能中和HCV,但是在高免疫压力下,该区处在动态的变化中,清除HCV的能力下降,导致HCV在体内持续存在,影响疾病的进程和转归〔13〕,且HCV/HIV混合感染者更易发展为肝纤维化〔14〕。本研究发现脯氨酸只出现在23位甘氨酸的两侧,与国内外大多数研究结果一致,提示不论是否合并 HIV感染,该区的变异都不是完全随机的,而是一种半保留的变异〔15, 16〕。而在单纯HCV感染组中却呈现出氨基酸的复杂多样性,保守程度较低。在单纯HCV感染组中,由于该氨基酸位置改变,使得机体内原有抗体无法与该抗原氨基酸位结合,清除变异了的HCV能力降低,进而导致HCV变异的积累,当变异积累到一定程度时,就会引起上述SSCP条带数、 核苷酸同源性的改变。进化树显示,变异趋势并未因组内的变异而产生不同,但合并HIV却引起了HCV变异趋势的改变。HCV/HIV合并感染组该区基因的同源性较HCV单纯感染组高,提示2组间HCV E2/NS1包膜区的进化无趋同性,且HCV/HIV合并感染组变异性较低,进一步表明HIV感染降低了HCV该区基因的变异性〔17〕。本研究结果表明,HIV感染降低了1b型HCV E2/NS1包膜区基因的变异,此情况主要集中在HVR-1区和HVR-3区。HVR-1区第2、6、 23、24、26、27位氨基酸位置全为保守序列,而第7、12、25位氨基酸位置,在HCV/HIV合并感染组中表现相对保守,但在单纯HCV感染组中却呈现出氨基酸的复杂多样性,保守程度较低。

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