评价生物防护服抗微生物悬浮液穿透性能,需选择合适的指示微生物。使用致病病毒株对人体存在安全隐患,因此通常采用理化结构及生物特性均相似的非致病病毒或噬菌体作为替代物进行生物防护研究^〔1〕。如噬菌体f₂已广泛用作肠道病毒的指示微生物^{〔2, 3, 4, 5〕}。

噬菌体是原核生物病毒,分为14个科^〔6〕,其中,球状噬菌体包括PhiX-174、f₂和MS₂,由于直径(24~30 nm)与肠道病毒相当,且远小于人类血源性病毒和呼吸道病毒,成为理想的人类致病病毒替代物^〔1〕。本文旨在为生物防护服抗微生物悬浮液穿透性能评价选择合适的人类致病病毒替代物,对PhiX-174、f₂、MS₂ 3种噬菌体的生物学性质进行比较研究,为中国今后制定相应标准及提高突发公共卫生事件的防控能力提供一定借鉴。

酵母粉、胰蛋白胨(英国OXOID公司);NaCl、KCl、CaCl₂均为分析纯(天津市博迪化工有限公司)。THZ-C恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂);CWY-100精密数字压力表(陕西创威科技有限公司)。

噬菌体PhiX-174(ATCC 13706B1)、MS₂(ATCC 15597B1)及其它们的宿主细菌E.coli (编号分别为ATCC 15597和ATCC 13706),均购自American Type Culture Collection (ATCC)。噬菌体f₂及其宿主菌E.coli (编号为285)均为中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所卫生监测中心保存。所有噬菌体及其宿主细菌E.coli的液体培养基配方如下(pH 7.3左右):胰蛋白胨8.0 g,氯化钾5.0 g,氯化钙0.2 g,表面活性剂0.1 mL,蒸馏水1 000 mL。所有噬菌体及其宿主细菌E.coli的固体培养基底部配方如下(pH 7.3左右):酵母粉1.0 g,NaCl 8.0 g,胰蛋白胨10.0 g,氯化钾5.0 g,琼脂15.0 g,1 mol/L氯化钙1.0 mL (高压灭菌后加入),蒸馏水1 000 mL。顶部培养基按照琼脂0.7%加入,其余与底部培养基配方相同。

制作含宿主菌的细菌培养液1 L,将5~10 mL噬菌体接种到上述细菌培养液中,确保噬菌体个数与细菌个数之比在0.1~2.0。将接种后细菌培养液在(36 ± 1)℃剧烈震荡培养1~5 h,取培养液在10 000 g下离心5 min,收集上清液,用孔径为0.22 μm的膜过滤即得纯化的噬菌体悬液,测定噬菌体的滴度并于4℃保存备用,此时测得的噬菌体滴度一般在10¹⁰ PFU/mL以上。挑战悬浮液中噬菌体的滴度必须在10⁸ PFU/mL以上,用营养肉汤稀释而来^〔7〕。

采用双层琼脂平板法^〔8〕。将噬菌体悬液做10倍系列稀释,将100 μL过夜放置的宿主菌E.coli培养液和10倍系列稀释后的噬菌体悬液加至各平皿的底层营养琼脂上(噬菌体悬液每一稀释度接种3个平板),倒入8 mL冷至45℃的上层培养基,充分混匀,凝固后37℃倒置培养,直至产生肉眼清晰可见的噬菌斑。噬菌体的滴度以平板噬菌斑形成单位(plague forming unit,PFU)表示。

取少量纯化噬菌体悬液滴于覆有Formvar膜的铜网上,用干燥滤纸从侧面吸去染液,自然干燥后用Philips Tecnai 10型透射式电镜观察。

将接种有合适滴度噬菌体的双层培养基平板于37℃培养不同时间,观察各种噬菌体形成明显噬菌斑的时间及其大小分布、形态。

感染复数(multiplicity of infection index,MOI)是指初始感染时加入噬菌体的数量与宿主菌数量的比值,也称感染倍数。按照感染复数为0.1的比例混合噬菌体和宿主菌后,迅速置于37℃,150 r/min摇床中培养并开始计时,每隔4 h取样,10 000 g离心10 min,取上清测定噬菌体滴度。

将60 mL噬菌体滴度为10⁹ PFU/mL的悬浮液注入到穿透试验槽后,将空气管道连接到穿透槽上,在1.75、3.5、7、14、20 kPa保持5 min后,测定噬菌体滴度,观察不同压力对噬菌体活力的影响^{〔7, 9〕}。

表 1

表 1 不同噬菌体双层平板噬菌斑大小分布

表 1 不同噬菌体双层平板噬菌斑大小分布

噬菌体PhiX-174、f₂、MS₂噬菌斑形态均为圆形,PhiX-174噬菌斑最佳观察时间在培养5 h左右,此时噬菌斑清晰,平均直径为2.57 mm,培养15 h时,噬菌斑巨大,逆光观察噬菌斑呈透明状,边界清楚。f₂和MS₂培养5 h,噬菌斑仍然不明显,培养15 h,逆光观察均呈透明状,边界清楚,MS₂噬菌斑周边有晕圈。通过对比,PhiX-174检测时间短,检测方法敏感,所形成的噬菌斑清晰,便于统计。

扫描电镜下观察噬菌体PhiX-174、f₂、MS₂均为正二十面体,其中,PhiX-174直径25~27 nm,各角顶有类似结节状的刺突(图 1A);f₂直径约24~26 nm,无刺突(图 1B);MS₂直径约26 nm,无刺突(图 1C)。因此,3种噬菌体直径相近,均在25 nm左右,且远远小于人类血源性病毒和呼吸道病毒^〔1〕,均可以替代人类血源性病毒和呼吸道病毒,作为生物防护服防病毒效果评价指示病毒的候选株。

图 1

图 1 不同噬菌体电镜图(A:PhiX-174;B:f2;C:MS2)

实验结果表明,PhiX-174的繁殖力最强,当初始噬菌体浓度为2.2 × 10⁵ PFU/mL时,4 h即可迅速增殖到1.67 × 10¹⁰ PFU/mL,24 h可以达到10¹² PFU/mL以上;MS₂和f₂的繁殖力相当,在24 h内缓慢由2.1 × 10⁵ PFU/mL增殖至1011 PFU/mL左右。

将滴度为10⁹ PFU/mL的PhiX-174、f₂、MS₂悬液分别在1.75、3.5、7、14、20 kPa下作用5 min后,测定噬菌体滴度。结果表明,3种噬菌体均有一定耐压力,均未见噬菌体滴度明显减少。

在高危生物污染环境作业的人员,很容易接触到可以传播疾病、可能含有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷性病毒等血源性病毒的血液、体液和其他具有潜在传染性的物质。1992年,国际消防战士协会(IAFF)的伤亡调查表明,每15个消防员中就有1个队员接触到传染病,其中有12.6%是乙肝,21.9%是艾滋病^〔10〕,因此,为最大限度保护民众健康,避免疫情传播,各国都越来越重视高安全性生物防护服的研究和开发,该类防护服不仅要求能有效阻止生物气溶胶的吸入、沾染,而且还能阻止含微生物液体(包括病毒)的渗透。

目前,国际上检测生物防护服抗微生物穿透性能的方法主要有正压法^{〔7, 11〕}和负压法^{〔12, 13〕}2种。美国材料实验协会的防护服标准ASTM F1671-2003及国际标准ISO 16604均利用噬菌体PhiX-174作为挑战微生物,通过正压法测试材料的穿透性^{〔7, 14〕},而中国则是采用负压法观察测试材料是否能够抵御脊髓灰质炎病毒的穿透^〔12〕。与脊髓灰质炎病毒相比,噬菌体具有培养快速、操作简便等特点,因此本研究选择PhiX-174、MS₂和f₂等3种常见噬菌体作为研究对象,综合观察其生物学性质,筛选出最适合的指示病毒。结果表明,PhiX-174、MS₂和f₂ 3种噬菌体对人类不具有感染性,具有生物安全性、一定耐压性和环境稳定性,且大小合适,均可作为生物防护服防病毒效果评价的指示病毒候选株。但是,由于PhiX-174较MS₂和f₂繁殖能力强,用双层平板法检测时间短,方法敏感,结果可靠,因此,噬菌体PhiX-174最适于作为生物防护服抗病毒效果评价的指示病毒。