霍乱是由定居小肠的非侵袭性霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的烈性肠道传染病,其爆发流行是许多国家危害人民健康的重要公共卫生问题,目前主要由O1群和O139群霍乱弧菌引起。霍乱弧菌不同菌株间致病力存在明显差异,流行株具有引起霍乱流行和大流行的能力,而非流行株不致病或仅引起散发腹泻病例,因此流行株与非流行株的区分对于霍乱的预防与控制十分重要。中国建立的霍乱弧菌噬菌体-生物分型方案,在霍乱防治中发挥了重要作用,其中山梨醇发酵试验在反映O1群埃尔托型霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌致病力方面具有一致性规律:流行株为山梨醇慢发酵,非流行株为山梨醇快发酵^〔1〕。随着霍乱弧菌毒力蛋白及毒力相关基因研究的深入,研究结果提示,糖发酵激活蛋白(sugar fermentation stimulation protein)在流行株与非流行株的山梨醇发酵试验中存在明显差异^〔2〕。本研究拟采用PCR定向克隆技术对江苏省无锡市锡山地区分离的一株霍乱菌株糖发酵激活蛋白编码基因序列测定,并与其他菌株进行比较分析,探讨糖发酵激活蛋白在流行株与非流行株中潜在的意义。

霍乱弧菌04-5a株系2004年5月江苏省无锡市锡山前州食物中毒事件的患者排泄物中分离鉴定的O139菌株,N16961株与92-3株分别为糖发酵激活蛋白基因序列已经清楚的O1群埃尔托型流行株与O139非流行株^{〔2, 3, 4〕}。菌株中国医学细菌保藏管理中心与无锡市疾病预防控制中心专业实验室提供,霍乱弧菌流行株与非流行株的分类按我国噬菌-生物分型方法进行。质粒载体pMD18-T Vector (日本,TaKaRa公司)。

DNA提取应用genomic DNA isolation kit (博大泰克公司),PCR引物由上海Sangon公司合成,三磷酸脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)、Tag DNA聚合酶、限制性内切酶和DNA标准分子量参照(英国TaKaRa公司)。DNA序列分别由上海Sangon和上海博亚生物技术公司完成。PCR扩增仪为PE4800。基因分析计算机软件为primer5.0。

根据已发表的霍乱弧菌流行株N16961(NC_002505)基因序列设计引物^{〔5, 6〕}。糖发酵激活蛋白编码基因的引物序列为:5'-TCAATTTTTTGTCACTTG和5'-ATGCCTTCGCCATTGGC。反应体系与反应条件如下:10 ×扩增缓冲液5 μL,MgCl2 2 mmol/L混合4种dNTP200 μmol/L,混合4种引物各20 pmol,模板DNA10 ng加DDW至50 μL,混合后加入高保真TaqDNA聚合酶2 u。预变性95℃ 7 min;94℃ 1 min,61℃ 1 min,72℃ 1 min 3个循环;91℃ 1 min,63℃ 1 min,72℃ 1 min 25个循环;72℃延伸10 min。

基因克隆、质粒提取和感受态细胞制备与重组质粒的酶切鉴定按常规方法进行。由上海Sangon 公司完成重组质粒上插入片段序列测定。

应用设计的2对引物扩增3株霍乱菌株的糖发酵激活蛋白,产生了预期的约771 bp的特异产物带,阳性扩增率为100%。

图 1

注:1:分子量标准;2:菌株N16961;3:菌株04-5a;4:菌株92-3。 图 1 糖发酵激活蛋白编码基因PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳(1.5%)

对江苏无锡锡山分离株04-5a与流行株N16961和非流行株92-3的相关序列比较发现,04-5a株与N16961株两者基因完全相同.与非流行株在334、622和666位核苷酸碱基的差异(非流行株为G、C和C,流行株分别为A、T和T)。根据碱基推导其氨基酸序列可知,第666位碱基的差异导致编码蛋白的氨基酸由非流行株的丙氨酸变为流行株的苏氨酸。应用无意义链(转录链)对04-5a菌株的糖发酵激活蛋白的基因序列和推导的氨基酸序列与92-3株与N16961株的相关序列进行比较,结果表明,04-5a株糖发酵激活蛋白的基因由771个碱基对组成,具有典型的原核基因结构特征。起始密码子ATG位于碱基的0~3处,终止密码子TGA位于碱基769~771处,从起始密码子到终止密码子的开放阅读框全长为768 bp,共翻译258个氨基酸组成的蛋白质。推导信号肽序列由成熟肽的NH2-端丙氨酸上游33个密码子组成,信号肽序列的-1,-3位切割三联体为ALF。04-5a株糖发酵激活蛋白序列由编码基因推导氨基酸的组成分为3个部分,即NH2-端,Cys-Cys环区和COOH-端。其中-NH2端、-COOH端和信号肽序列为遗传高度保守区域。

图 2

注:92-3:92-3菌株的糖发酵激活蛋白的基因序列N;16961:N16961菌株的糖发酵激活蛋白的基因序列;04-5a:04-5a菌株的糖发酵激活蛋白的基因序列;AA:推导的氨基酸序列;黑体与():碱基与氨基酸的变化;***:终止密码。 图 2 04-5a菌株糖发酵激活蛋白基因和氨基酸序列与菌株92-3与N16961相关序列比较

霍乱是一种严重危害人类健康的烈性肠道传染病,其流行株与非流行株的致病性存在显著差异,因此,菌株的分型鉴定对于霍乱的预防与控制十分重要。本研究采用PCR克隆技术对霍乱04-5a株糖发酵激活蛋白编码基因序列测定,并与其他菌株进行比较分析发现,糖发酵激活蛋白编码基因与流行株完全相同,与非流行株在334、622和666位核苷酸碱基的差异(非流行株为G、C和C,流行株分别为A、T和T)。第666位碱基的差异导致编码蛋白的氨基酸由非流行株的丙氨酸变为流行株的苏氨酸。由于丙氨酸为非极性疏水氨基酸,苏氨酸为极性中性氨基酸并可在信号转导过程中磷酸化,而此处位置又恰在蛋白质的NH2-端紧邻信号肽切割三联体(中间仅间隔2个氨基酸残基),本研究推测,这一改变有可能影响菌株糖发酵激活蛋白信号肽切割方式与细胞信号转导通路中蛋白的磷酸化,进而对快慢发酵产生直接影响,这一改变可能对区分霍乱菌株的流行株与非流行株具有分子标识的潜在价值。已有研究结果表明,霍乱弧菌流行株中存在许多外源基因片断,然而在细菌进化过程中流行株是否较非流行株更易接受外源基因片断,是否是造成这种差异的原因,至今仍未明确,这种差异的原因仍未明确^{〔5, 6, 7〕}。结合本实验的研究结果,虽然流行株与非流行株在糖发酵激活蛋白编码基因的改变具有一定的规律性,但影响霍乱弧菌甘露糖快慢发酵的内在机制可能复杂的多,有待进一步深入研究。