细菌生物被膜(bacterial biofilm,BBF)是指多个细菌不可逆地黏附于机体或物体表面,被自身细胞分泌的基质所包裹,是与浮游细菌不同的新表型^〔1〕。在许多医学生物材料引起的相关感染在院内感染疾病中起着重要作用,所致疾病迁延不愈,因此,防止其形成和有效清除已形成的生物被膜,在临床实践中至关重要^〔1〕。新生儿重症监护室(neonatal intensive care unit,NICU)危重患儿常因使用保温箱、呼吸机及反复吸痰等,继发感染的风险提高^〔2〕,此种感染在有侵入性导管应用者尤为突出^〔3〕。本研究以NICU置入的导管为研究对象,进行细菌学检查及抗吞噬作用观察,探讨侵入性导管内细菌生物被膜抗吞噬作用。结果报告如下。

以辽宁省沈阳市多家医院新生儿重症监护室应用呼吸机进行辅助通气的新生儿为研究对象,于2010年7月-2011年12月收集危重新生儿病例呼吸机导管标本32份,其中新生儿肺炎14例,早产儿9例,新生儿高胆红素血症5例,新生儿头颅血肿4例。年龄为1~28 d,女婴14例,男婴18例。

无菌操作下,将近人体端1 cm导管外壁70%酒精涂抹消毒后,纵向剪开,接种环灭菌刮取内壁后接种于LB肉汤培养基中增菌,37℃过夜,然后用其肉汤分区划线接种于血平板和中国蓝培养基,37℃培养24 h,可疑鲍曼不动杆菌菌落转种中国蓝培养基42℃过夜。第3区无色菌落初步确定为可疑鲍曼不动杆菌。

经初步鉴定的菌种,采用ATB生化鉴定分析仪(生物一梅里埃公司),按ID 32 GN革兰阴性杆菌鉴定试条(Ref.32 100)说明书进行鉴定到种。纯化的鲍曼不动杆菌菌株在刚果红培养基培养^〔4〕,产生生物被膜的菌株菌落呈深红色,非模式株菌落为无色。葡萄球菌快速鉴定试条ID 32 STAPH (Ref.32 500)鉴定葡萄球菌。

将临床常用导管标本,剪成直径5 mm圆片,高压灭菌,备用。无菌操作将其浸泡于24孔培养板,每孔1.5 mL LB肉汤,接种临床分离并鉴定为鲍曼不动杆菌菌株,阳性对照组为鲍曼不动杆菌19606菌株^〔5〕(沈阳医学院保存传代),阴性对照组为枯草芽胞杆菌,封口膜封口培养板防止污染,Innova40温控摇床37℃连续震荡培养,振幅为50Hz,每隔48h取出磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲洗圆片,除去浮游菌,圆片置于新培养板,重新加入新的等量培养液。

分别于振荡培养后的3、5、7 d,将引流导管片经2.5%戊二醛4℃下固定24 h,pH 7.2的PBS冲洗3次,再以1%的锇酸4℃固定2 h,4℃双蒸水冲洗3次,梯度乙醇脱水,醋酸异戊酯置换,CO2临界点干燥,离子喷金镀膜,通过KYKY3200 SEM扫描观察引流管内壁生物被膜形态结构。

新生儿脐带抗凝血2 mL经Hank液1:1稀释后,重悬于同体积淋巴细胞分层液,2000 r/min,20 min,收集外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),即有核细胞(PBMC)层,Hank's液洗涤PBMC 1次,1500 r/min,10 min,弃去上清,备用。

将上述制备的导管片取出,用超声微处理器(150 W,10 min)洗脱生物被膜,同时制备鲍曼不动杆菌及表皮葡萄球菌浮游菌液(5 × 107个/mL)为对照组,吞噬细胞分别与细菌生物被膜及浮游菌等共同培养20 min后涂片^〔6〕,常规瑞-吉染液染色观察吞噬现象。

32例导管标本,经分离培养,ATB生化鉴定:鲍曼不动杆菌14株(43.75%),铜绿假单胞菌9株(28.13%),葡萄球菌6株(18.75%),真菌3株(9.38%)。

14株鲍曼不动杆菌标本中有8株在刚果红培养基不同程度菌落呈深红色,确认为产生生物被膜菌株,阳性率为57.14%(8/14)。另6株菌在刚果红培养基培养,菌落始终为无色。

扫描电镜显示,导管材料表面可见由粘液、纤维素样物质交联成网状,菌体依附于纤维物质表面或堆积、埋藏其内部,组成膜状结构,即细菌生物被膜(图 1A),膜厚度超过5 μm;新分离的葡萄球菌(阴性对照)为浮游状态生长,无细菌生物被膜形成(图 1C)。

图 1

图 1 细菌生物被膜形态结构(×3 000)

经分层液分离的吞噬细胞,包括巨噬细胞、中性粒细胞,细胞悬液经瑞-姬染色,显示中性粒细胞胞核呈杆状或2~5分叶状,叶与叶间有细丝相连。巨噬细胞为大单核细胞,细胞核不分叶,胞体超过粒细胞近2倍,镜下也可见淋巴细胞存在,核几乎占据整个细胞,胞浆少。

吞噬细胞与浮游细菌在37℃下混合0.5 h,血片染色可见吞噬细胞,特别是中性粒细胞能够完成趋化、吸附、吞噬过程(图 2A)。

图 2

图 2 吞噬细胞吞噬浮游细菌及生物膜抗吞噬(×1000)

将吞噬细胞与细菌生物被膜在37℃时共育0.5 h,血片染色可见吞噬细胞尽管也能够趋化,甚至吸附含细菌的生物被膜,但却不能将生物被膜吞入(图 2B),最终反被生物被膜包裹(图 2C)

自发现BBF以来,国内外学者对细菌生物被膜研究逐步深入,研究发现在细菌生物被膜屏障作用^〔7〕的保护,是感染难治的重要因素之一^〔8〕。本研究结果表明,NICU的危重新生儿呼吸机导管内可检出多种细菌,并且鲍曼不动杆菌有较高检出率,其他混合感染的细菌中铜绿假单胞、表面葡萄球菌为主要菌株。

本研究结果还表明当导管浸入于肉汤培养液中,摇床连续振荡,模拟导管液体流动状态,3 d即可形成不易剥离的生物被膜,提示具有较强粘附性的机会致病菌一旦定植于导管,在导管内的气体或液体的流动冲刷下,容易形成生物被膜。尽管体外试验浮游细菌对某些抗菌药物敏感,但是抗菌药物对生物膜内的细菌却因膜屏障而无能为力,鲍曼不动杆菌形成的生物被膜,可能是导致ICU患者呼吸道感染鲍曼不动杆菌呈逐年增多的重要原因。

研究发现,当冲洗导管时,灌注液的剪切力或冲击力超过细菌生物膜的张力时,导管中生物膜表面细菌会脱落,吞噬细胞可以对浮游细菌进行吞噬清除。但当导管与机体连接时,这种冲洗是否会帮助细菌播散^〔9〕,或许是细菌生物被膜引起感染反复发作的主要原因,需引起足够重视。通过超声波洗脱下的生物被膜碎片与吞噬细胞共育时,虽然吞噬细胞对细菌生物被膜有趋化作用,但吞噬细胞不能通过吞入过程直接清除细菌生物被膜,细菌生物被膜不仅具有明显抗吞噬作用,甚至吞噬细胞可被生物被膜包裹后限制其自身吞噬功能。鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌及表皮葡萄球菌在自然环境中普遍存在,具有较强粘附性,属于条件致病菌,侵入性导管高感染率的重要原因与细菌在导管中黏附、定植形成生物被膜有关^〔10〕,所以盲目冲洗可导致生物被膜脱落及播散,加重感染。