庆大霉素以其价廉高效性被普遍用于革兰阴性细菌感染的治疗,但使用不当可导致永久性听功能损伤。为避免孕期感染造成流产,围产期妇女使用庆大霉素几率相对增加^〔1〕,而子代对庆大霉素暴露更敏感。哺乳动物围产期毛细胞减少可导致成年后听力损伤,庆大霉素通过凋亡途径造成Corti器外毛细胞损伤,并引起线粒体内稳态失衡^〔2〕。细胞器内酯酰基活化与跨膜转运均需L-肉碱的参与,L-肉碱对老年性耳聋引起的线粒体功能减退具有延缓作用^〔3〕。本研究以围产期豚鼠为模型,探讨L-肉碱对庆大霉素致子代听力下降和耳蜗毛细胞凋亡的干预作用,结果报告如下。

L-肉碱(美国Sigma公司);庆大霉素(南京第三制药厂);兔抗caspase-3多克隆抗体(美国Cell Signalling Techenology公司);原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labelling,TUNEL)试剂盒(美国BD Biosciences公司)。HL-2恒流泵(上海嘉鹏科技有限公司);YABO组织包埋机(上海富众仪器有限公司);MTC冰冻切片机(德国SLEE公司);BX51光学显微镜(日本Olympus光学工业)。

耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠(中国医科大学动物部)18只,孕(28 ± 4) d,体重650~700 g。实验动物生产许可证号:SCXK (辽)2003-0009;使用许可证号:SYXK (辽)2003-0013。所有动物均无噪声接触史并于安静的环境下饲养。

适应性饲养3 d后,按体重随机分为对照组(从孕51~57 d,每天腹膜内注射生理盐水100 mg/kg)、庆大霉素组(从孕51~57 d,每天腹膜内注射庆大霉素100 mg/kg)、L-肉碱组(从孕51~57 d,每天腹膜内注射庆大霉素100 mg/kg,同时给予含100 mg/mL L-肉碱饮水),每组6只孕鼠。给药期间庆大霉素组1只孕鼠死亡,共出生子代豚鼠55只。出生后14 d,乙醚麻醉,畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE)检测听力状况;分离耳蜗,制备冰冻切片,应用TUNEL染色和免疫组化检测毛细胞凋亡情况。

隔音室内选择初始纯音f₁与f₂,f₁/f₂=1.22,(f₁+f₂)/2=1~8 kHz。强度差L₁-L₂=10 dB声压级(sound pressure level,SPL),取DPOAE幅值超过本底噪音3 dB为DPOAE检出标准,测试频率f₀ ²=f₁ × f₂为1、2、4、6、8 kHz处的幅值。

冰冻切片干燥,过氧化物酶阻断,室温10 min,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗5 min,3次。滴加正常山羊血清封闭,室温50 min,滴加一抗,4℃过夜。PBS冲洗,滴加生物素标记二抗,室温50 min。PBS冲洗,滴加链霉素亲和素过氧化物酶溶液,37℃ 30 min,PBS冲洗。DAB显色,苏木素复染,常规酒精梯度脱水,二甲苯透明,甘油封片。在400倍光镜下,分别对Corti器、血管纹及螺旋神经节进行细胞计数,计数时统一计数区域,将每个标本共3个视野的阳性细胞数取平均值,伴为该标本的阳性细胞数。

采用TUNEL法,冰冻切片干燥,过氧化物酶阻断,室温10 min,PBS冲洗5 min,3次,0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl buffer saline,TBS)1:100新鲜稀释蛋白酶K 37℃消化10 min,按每张切片取末端脱氧核苷酸转移酶和DIG-d-UTP各1 μL,加10 μL抗体稀释液,每片加标记液20 μL,湿盒37℃ 2 h,PBS冲洗,滴加封闭液,每片50 μL,室温50 min,PBS冲洗,用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体,每片50 μL,37℃ 30 min,PBS冲洗。DAB显色,苏木素复染,常规酒精梯度脱水,二甲苯透明,甘油封片。光镜下观察Corti器、血管纹及螺旋神经节棕色TUNEL阳性反应细胞并计数。

实验数据用x±s表示,以SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析及χ²检验,检验水准为α=0.05。

各组间亲代生殖指标和子代体重差异无统计学意义(P > 0.05)。

表 1

表 1 母体生殖指标和子代体重比较

表 1 母体生殖指标和子代体重比较

与对照组比较,庆大霉素组子代豚鼠DPOAE幅值降低,差异有统计学意义(F=31.196,P < 0.01);对照组与L-肉碱组子代豚鼠DPOAE水平差异无统计学意义(P > 0.05)。

表 2

表 2 各组子代豚鼠DPOAE比较(dB,x±ss)

表 2 各组子代豚鼠DPOAE比较(dB,x±ss)

对照组未见毛细胞caspase-3阳性染色(图 1A);庆大霉素组子代豚鼠在耳蜗基底膜毛细胞caspase-3阳性染色明显(图 1B,黑色箭头指示棕黄色颗粒沉淀);L-肉碱组caspase-3阳性染色不明显(图 1C);L-肉碱组caspase-3阳性细胞百分率(37.2%)明显低于庆大霉素组(61.1%),差异有统计学意义(F=74.756,P < 0.01)。

图 1

注:A:对照组;B:庆大霉素组;C:L-肉碱组。 图 1 L-肉碱对庆大霉素致子代耳蜗caspase-3表达的影响(免疫组化染色,× 400)

对照组中毛细胞核内无棕色或棕褐色着染,形态规整,排列整齐;庆大霉素组子代豚鼠耳蜗部分毛细胞核呈棕色或棕褐色染色,形态不规整,排列紊乱,大小不一,属明显凋亡特征,其毛细胞凋亡率为34.6%;L-肉碱组耳蜗毛细胞凋亡率为15.7%,与庆大霉素组比较,差异有统计学意义(F=29.630,P < 0.01)。

庆大霉素作为氨基糖甙类抗生素代表,其耳毒性及其机制研究日益增多。本研究动物模型采用妊娠晚期给药借以模拟接近自然病理过程。虽然庆大霉素可引起体内分泌孕酮与促黄体生成激素紊乱^〔2〕,进而引起子代生理状况改变,但本研究结果显示,庆大霉素并未影响母体产子数和子代体重等一般生理指标,可能与给药剂量、方式及时间有关。豚鼠出生1周后能在听觉系统记录到声音诱发的神经电活动,本研究结果表明听觉发育期庆大霉素暴露可造成子代DPOAE幅值降低,听力下降,提示庆大霉素可通过胎盘对子代造成听力损伤,而同时给予L-肉碱能减弱这种不良效应。

听觉发育关键期毛细胞受损会导致成年后听力受损^〔2〕。细胞凋亡是组织死亡过程中的主要细胞死亡方式之一。本研究结果显示,听觉发育期庆大霉素暴露导致子代豚鼠耳蜗毛细胞凋亡,耳蜗毛细胞caspase-3免疫阳性表达。Caspase-3在凋亡的启动过程中发挥重要作用^〔4〕。抑制caspase-3酶活性或拮抗caspase-3功能可使细胞凋亡受抑^〔5〕。L-肉碱在脂肪酸酯基转移反应中利用其羟基基团,不同链长的脂肪酸使用不同的特异性肉碱依赖性蛋白,其主要功能是将脂酰基转移进入线粒体以进行β-氧化^〔3〕。由此提示,L-肉碱对庆大霉素暴露致子代听力下降的干预作用,可能是通过其抑制庆大霉素催化氧自由基的产生而实现的。