高效氯氰菊酯(β-CP)是中国广泛使用的拟除虫菊酯类农药,具有高效,速杀,广谱等优点。近来来调查发现在食物及环境中存在β-CP残留^{〔1, 2〕},而环境中残留的低水平β-CP对雌性生殖健康的危害也逐渐受到国内外学者关注^{〔3, 4〕}。相对于成年,幼年机体处于发育期,暴露于具有内分泌干扰作用的农药以后会表现出更为强烈的健康危害,易导致永久性性发育损害^〔5〕。目前,β-CP对幼年雌性机体的性腺毒性及内分泌干扰效应方面的报道较少。本研究在参考了经济合作和发展组织(OECD)推荐的Guideline 407实验基础上,设计了28d经皮染毒实验,通过观察雌性幼鼠阴道开口时间,动情周期,子宫及卵巢脏器湿重及系数,血清雌二醇,子宫内膜雌激素受体(estrogen rececptor,ER),旨在为β-CP雌性生殖毒性研究及危险度评价提供毒理学资料。

β-CP (纯度> 95%,市售原药),溶剂为100%精制花生油;E₂放免试剂盒(天津九鼎生物技术公司),ER免疫组化试剂盒(天津明川生物公司)。

刚断乳雌性SPF级昆明小鼠(中国军事医学科学院动物中心)40只,体重12~16 g,动物许可证号SCXK-(军)2007-004,适应性喂养3 d,按体重随机分为4组,分别为溶剂对照组(精制花生油),低,中,高剂量β-CP组,每组10只。剂量分别为0.1、1.0、10 mg/kg,采用腹部或脊柱两侧皮下注射给药,每天1次,连续注射28 d,自由饮食,室温20~24℃,湿度为40%~60%,12 h/12 h明暗周期。

从染毒第1 d起,每天早上7:00观察并记录雌性小鼠阴道开口时间。染毒结束后,每天早晚7:00采用阴道脱落细胞涂片法观察并记录小鼠的动情周期变化,观察期限为4 d^〔6〕。

染毒结束后,于动情间期摘眼球取血,颈椎脱臼处死动物。取卵巢及子宫,除去脂肪及结缔组织,用滤纸吸干后用万分之一分析天平准确称量卵巢及子宫重量。子宫剥离重测定方法:用刀片划开子宫角,用镊子轻轻按压子宫组织,注意避免破坏子宫组织完整性,将子宫腔液体挤出,称量。子宫系数=子宫剥离重/体重;卵巢系数=卵巢湿重/体重。

血液标本于4℃静置2 h后,2 000 r/min离心20 min,取血清置-20℃冰箱保存,采用放射免疫法测定E₂。

将一侧子宫置于4%中性多聚甲醛中固定7 h,脱水,包埋,组织块行5 μm切片,60℃烤片2 h后进行免疫组织化学染色,严格按照检测试剂盒操作规程进行操作。40倍镜下观察子宫内膜下层腺体数量,用IMAGE-PRO PLUS 5.0图象分析软件测定ER阳性表达率,以细胞核和/或细胞浆内出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞,计数200个子宫内膜细胞中阳性细胞数,每张切片至少计数5个视野,ER阳性表达率=阳性细胞数/200。

结果用x±s差表示,采用SPSS 13.0统计软件单因素方差分析(ANOVA)进行方差齐性检验与差异显著性分析,卵巢湿重及系数方差不齐采用Tamhane检验,其余指标组间采用最小显著差法进行比较,检验水准α=0.05。

染毒初期幼鼠易激怒,活动增多。染毒后期,高剂量染毒组活动明显减少,个别动物出现轻微震颤,被毛缺乏光泽。中高剂量组各死亡1只小鼠,对死亡小鼠行常规病理检查发现腹腔内有不同程度非血性渗出液,未见脏器及卵巢有明显病理学改变。

截止到染毒结束,各组小鼠阴道已开口,阴道开口时间无明显差别。各β-CP剂量组动情期时间均低于对照组,高剂量组动情期维持时间最短,只有12 h左右;中、高β-CP剂量组动情间期时间为50 h左右,而对照组及低β-CP剂量组动情间期则为30 h左右。

与对照组比较,各剂量染毒组体重及卵巢系数无明显改变(P > 0.05)。高剂量组子宫湿重明显高于对照组(t=2.27,P < 0.05),但子宫组织重及子宫系数则无明显差异(P > 0.05),提示高剂量组子宫增重效应可能是由β-CP引起子宫水肿而造成。

表 1

表 1 β-CP染毒对小鼠子宫及卵巢重量及其脏器系数影响(x±s)

表 1 β-CP染毒对小鼠子宫及卵巢重量及其脏器系数影响(x±s)

与对照组比较,各剂量组血清雌二醇水平及子宫腺体个数变化不明显(P > 0.05),中、高剂量组子宫内膜ER受体阳性表达率低于对照组(t=2.83、7.38,P < 0.01,)而且各剂量组之间ER表达率呈一定剂量效应关系,提示β-CP对雌性小鼠子宫内膜ER具有一定毒性,能减少ER表达。

表 2

表 2 β-CP染毒对小鼠血清E2水平及子宫内膜ER阳性表达影响(x±s)

表 2 β-CP染毒对小鼠血清E2水平及子宫内膜ER阳性表达影响(x±s)

氯氰菊酯具有内分泌干扰作用,长期低水平接触高效氯氰菊酯对幼年雌性机体的性腺生殖毒性研究较有意义。雌性机体性发育依赖于下丘脑-垂体-卵巢轴的稳定。阴道开放及动情周期变化往往可以反映机体性激素水平及性腺轴功能。本研究结果表明,雌性幼鼠暴露于β-CP至性成熟后动情周期发生了改变,动情期缩短,动情间期延长,提示发育期的幼鼠接触β-CP后性腺轴功能出现了紊乱。本研究结果表明,β-CP并未影响血清雌激素水平,β-CP可能是通过影响其他性激素发挥内分泌干扰作用。

雌激素在体内作用依靠与ER结合,研究表明环境雌激素能通过ER介导的通路刺激子宫增生及DNA合成^{〔7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19〕},本研究结果显示,高剂量组小鼠子宫湿重增加,而剥离重及子宫系数无明显差异,提示子宫组织并未增生,而子宫湿重增加可能由水肿引起。子宫组织免疫组化分析显示,中、高剂量组小鼠子宫内膜ER表达阳性率比对照组低,表明β-CP能降低子宫组织ER表达,这可能是β-CP雌性生殖毒性作用的机制之一,β-CP对幼年雌性生殖的毒性作用具体机制有待进一步探讨。