痛风是因嘌呤代谢障碍而导致血尿酸水平增高，和(或)因尿酸排泄减少而导致尿酸盐在组织中沉积的疾病^{〔1, 2〕}。痛风患者除了药物治疗外，亦采取饮食控制，减少由饮食中摄取过多嘌呤物质，以达到控制病情的效果^{〔3, 4, 5〕}。菌类食品营养丰富，是不可多得的药食两用的食物来源。然而菌类食物中含有一定量的嘌呤，容易诱发痛风^〔6〕，因此对菌类食品中嘌呤的检测尤为重要。本研究通过探讨菌类食品的水解条件以及高效液相色谱分离条件，建立了菌类食品中的嘌呤测定方法，旨在为食品中嘌呤的检测提供参考。

1 材料与方法 1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，配有紫外检测器及化学工作站(美国Agilent公司);Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm，美国Agilent公司);800型离心沉淀器(上海手术器械厂);电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂);雷磁pHS-3C型精密pH计(上海精密科学仪器有限公司);TG332A分析天平(湘仪天平仪器厂);H66025T超声清洗机(无锡超声电子设备厂)。

1.2 试剂与材料

鸟嘌呤(guanine)、次黄嘌呤(hypoxanthine)、黄嘌呤(xanthine)、腺嘌呤(adenine)(上海索莱宝生物科技有限公司)，纯度＞ 99%;甲醇(色谱纯);高氯酸(优级纯);氢氧化钾、磷酸、磷酸二氢钾均为分析纯;蒸馏水(电导率＜1.0 μS/cm，0.45 μm滤膜过滤);菌类食品均从超市购买，经除杂质，采用粉碎机粉碎后过40目筛，烘箱干至恒重后放干燥器备用。

1.3 嘌呤标准溶液的制备

0.2 g/L各嘌呤储备液:精确称取鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤各0.02 g，用1 mol/LNaOH溶解，定容至100 mL，4 ℃保存备用。

1.4 样品前处理

准确称取0.2 g的菌类样品于10 mL离心管中，加入10%(v/v)的HClO₄溶液5 mL，100 ℃恒温水浴60 min后，冰浴冷却，以10 mol/L的KOH调节pH至7.0，定容至10 mL，以3 000 r/min离心30 min，取1 mL离心上清液，用0.1 mol/L的H₃PO₄调其pH=4.0后，稀释定容至一定体积(不同样品定容体积有所不同)，再以3 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜后进高效液相色谱仪测定。

1.5 色谱条件

色谱柱: Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm);流动相: 0.007 mol/L KH₂PO₄(pH=4.0)缓冲液;柱温: 25 ℃;流速: 1.0 mL/min;紫外检测器波长: 254 nm;进样量: 20 μL。

2 结果 2.1 色谱分离条件的选择(图 1)

经过对流动相的pH和浓度优化选择，pH=4.0的0.007 mol/L的KH₂PO₄溶液能使4种嘌呤较好分离。

2.2 样品前处理条件选择 2.2.1 最佳酸浓度的选择

食品中的嘌呤物质一般是以核酸中嘌呤碱基的形式存在，在测定前需先通过酸水解成嘌呤碱基再进行分析^〔7〕。本试验中用HClO₄对菌类样品进行水解，酸的体积用量要能保证与菌类食物充分接触，才能对嘌呤充分水解，本试验中0.2 g菌类样品所用HClO₄的体积为5 mL。

酸的浓度是影响嘌呤水解的一个重要因素，对酸浓度的选择方法如下:准确称取0.2 g的茶树菇样品若干份，分别加入5%(均为v/v)、 10% 、 25% 、 50% 、 70%和纯的HClO₄各5mL，通过计算每百克总嘌呤含量，观察最佳的HClO₄浓度。结果表明: 10%和25%的HClO₄消解效果好，高浓度的HClO₄会降解嘌呤。另外，为了消除残留的ClO₄^-对色谱测定的影响，需用KOH中和除去，HClO₄浓度越高在中和的时候反应越剧烈，且生成大量的KClO₄沉淀，综合考虑，本试验选择5 mL 10%的HClO₄消解样品。

2.2.2 水解温度和时间的选择

影响嘌呤水解的另外一个重要因素是样品的水解温度和水解时间，本试验观察了温度为70、 80、 90及100 ℃时对菌类中总嘌呤含量的影响，结果表明，在100 ℃时菌类中的嘌呤物质水解较为完全，其他温度不能够充分水解嘌呤物质。本试验还观察了时间为15、 30、 45、60、 90和120 min时对总嘌呤含量的影响，结果表明，随着时间的延长，总嘌呤含量逐渐增大，60 min时嘌呤含量最高，90和120 min嘌呤含量又呈下降趋势，最终确定最佳的水解条件为100 ℃下水浴60 min。

2.3 方法的线性范围

配制4种嘌呤混合标准溶液系列，在上述选定的仪器条件下进行高效液相色谱分析测定，每个浓度平行测定3次，将峰面积的平均值与所对应的标准溶液浓度作线性回归，得到鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤的线性回归方程分别为: y=75.42x+5.61(r=1.000 0);y=85.91x+5.21(r=1.000 0);y=54.76x+5.15(r=0.999 9);y=104.88x+31.78(r=0.999 7)。在0.1～25 mg/L的浓度范围内，4种嘌呤的响应峰面积与浓度呈良好线性相关。

2.4 方法的精密度和准确度(表 1)

用茶树菇样品进行加标回收和精密度试验，样品中分别添加2个水平嘌呤混合标准溶液，每个水平样品平行6份，计算加标回收率和相对标准偏差。

2.5 样品测定(表 2)

试验测定了人们食用较多的菌类(香菇、金针菇、银耳、平菇、木耳、茶树菇)中的嘌呤含量。

3 小结

本研究以高效液相色谱法对菌类食品中的嘌呤含量进行测定，相对标准偏差＜ 10.5%，样品加标回收率为77.2% ～98.7%。研究结果表明:鸟嘌呤和腺嘌呤在菌类中含量较高，次黄嘌呤和黄嘌呤含量较少。不同菌类中嘌呤含量差别较大，香菇中所含嘌呤总量最高，达到323.7 mg/100g，茶树菇最少，为39.2 mg/100g。建议痛风病人在食用菌类食品时，应有所选择，尽量选用嘌呤含量低的菌类，同时注意量的控制。