志贺菌属(Shigella)细菌通称痢疾杆菌，是一类具有极高传染性和危害严重的革兰阴性肠道致病菌。据报道，志贺菌属每年造成全球约1.6亿人患病，近110万人死亡，绝大多数为＜ 5岁儿童^{〔1, 2〕}。在中国感染性腹泻病原菌中志贺菌属致病率居于首位，因此志贺菌的检测是食品、饮料和饮用水卫生检验的一个重要检测指标。Vincent等^〔3〕于2004年发明了依赖解旋酶DNA恒温扩增(helicase-dependent isothermal DNAamplification，HDA)技术，目前，HDA方法已经应用于一些病原菌的检测。本研究建立了快速检测志贺菌的HDA新方法。结果报告如下。

宋氏志贺菌［ CMCC(B)51592］，痢疾志贺菌［ CMCC(B)51252］，福氏志贺菌［ CMCC(B)51572］，鼠伤寒沙门菌(ATCC 25241)，肠炎沙门菌(ATCC 13067)，甲型副伤寒沙门菌(ATCC 9150)，鸭沙门菌(ATCC 9270)，小肠结肠炎耶尔森菌［ CMCC(B)52207］，大肠埃希菌(ATCC25922)，弗氏柠檬酸杆菌(ATCC 43864)，布氏柠檬酸杆菌(ATCC 43162)，克氏柠檬酸杆菌(ATCC 27156)，产酸克雷伯菌(ATCC 43165)，河生肠杆菌(ATCC 51816)，阴沟肠杆菌(ATCC 700323)，产气肠杆菌(ATCC 13048)，气味沙雷菌(ATCC 33077)，液化沙雷菌(ATCC 27592)，奇异变形杆菌(ATCC 25933)，普通变形杆菌(ATCC 49132)，副溶血性弧菌(ATCC 17802)各1株，共21株菌株。试验用菌株分别购自美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection，简称ATCC)和中国医学细菌保藏管理中心(National Center ForMedical Culture Collection，MCC)。

大肠杆菌UurD解旋酶(上海富众生物科学有限公司);Bst polymerase、 MutL protein、 T4 gp32(美国NEB公司)DK-8DX型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司);DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂);Infinity3000型凝胶成像分析系统(法国VILBER INFINITY公司)。

本研究根据美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上已公布的志贺菌的侵袭性质粒抗原H(invasive plasmid，ipaH)基因序列(M76445)，采用Primer Premier 5.0引物设计软件，设计1对特异性扩增引物如下:(P1: 5'-TGCGTTTCTATGGCGTGT-3'，P2: 5'-CCCAGAGGGAGAACCAGTC-3')，预计扩增片段大小为108 bp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

按传统培养方法分别增菌培养1.1.1中的21株实验菌株。取实验菌株的细菌培养液1 mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，根据试剂盒说明书提取细菌DNA，保存于-20 ℃备用。所制备的模板，用于特异性和灵敏度等试验。

参考文献〔3, 4〕建立反应体系:根据引物Tm值，分别在49、 50、 51、 52、 53、 54℃进行实验，确定最佳反应温度。分别把反应时间定为30、 45、 60、 90、120 min，确定最佳反应时间。按照建立及优化的反应体系和反应条件对3株Shigella阳性菌株进行检测，以验证所建方法的可行性。

PCR反应体系(50 μL)为: 2×Taq PCR MasterMix 25 μL、 2条引物(10 μmol/L)各2 μL、模板DNA 2 μL、 ddH2O 19 μL。PCR反应程序为: 94 ℃预变性4 min，94 ℃变性15 s，51 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，进行35个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存反应产物。

用已建立的HDA方法对1.2.2中制备的21株实验菌株模板按照1.2.3中确定的HDA扩增条件进行扩增，电泳观察结果。

将经过增菌培养的Shigella标准菌株CMCC(B)51592，用0.85%生理盐水做成菌悬液进行平板计数并提取DNA。对所提取DNA进行10倍梯度稀释，对各梯度DNA进行HDA扩增，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测产物，确定灵敏度。

取1.2.6中提取的Shigella标准菌株CMCC(B)51592的各梯度DNA进行普通PCR扩增，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测产物。为增加可比性，2种方法采用相同的反应体积。普通PCR的引物与HDA方法引物相同。

反应体系为50 μL，采用两步法反应:反应液Ⅰ: 2 μL模板DNA，引物(10 μmol/L)各2 μL，10×buffer［ 350 mmol/L Tris-HAc(pH7.5)、 100 mmol/L二硫苏糖醇、 1 mg/mL牛血清白蛋白(baine serum albumin，BSA)、 100 mmol/L MgAc₂］ 2.5 μL，用ddH₂O补至25 μL。反应液Ⅱ: 10×buffer［ 350 mmol/LTris-HAc(pH 7.5)、 100 mmol/L二硫苏糖醇、 1 mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、100 mmol/LMgAc₂］ 2.5 μL，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)(100 mmol/L)1.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，Bstploymerase(8000 U/mL)2.5 μL，UvrD helicase(100 mg/L)1μL，MutL protein(600 mg/L)1 μL，T4 gp32(10 mg/ml)0.5μL，用ddH2O补至25 μL。反应液Ⅰ在95 ℃中水浴4 min，自然冷却到常温，将反应液Ⅱ加入反应液Ⅰ混匀，置51 ℃恒温扩增90 min。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测产物。

图 1

注: M: DNA Marker; 1: 空白对照; 2: 宋氏志贺菌; 3: 痢疾志贺菌; 4: 福氏志贺菌。 图 1 Shigella 的 HDA 检测结果

电泳结果显示，3株Shigella阳性菌株均出现阳性条带(图 1)，初步表明该方法可用于Shigella的检测。

图 2

注: M: DNA Marker;1:空白对照;2:宋氏志贺菌;3:痢疾志贺菌;4:福氏志贺菌;5:鼠伤寒沙门菌;6:肠炎沙门菌;7:甲型副伤寒沙门菌;8:鸭沙门菌;9:小肠结肠炎耶尔森菌;10:大肠埃希菌;11:弗氏柠檬酸杆菌;12:布氏柠檬酸杆菌;13:克氏柠檬酸杆菌;14:产酸克雷伯菌;15:河生肠杆菌;16:阴沟肠杆菌;17:产气肠杆菌;18:气味沙雷氏菌;19:液化沙雷氏菌;20:奇异变形杆菌;21:普通变形杆菌;22:副溶血性弧菌。 图 2 志贺菌特异性检测结果电泳图谱

用已建立的HDA方法对1.2.2中制备的21株实验菌株模板检测的电泳结果表明，宋氏志贺菌CMCC(B)51592，痢疾志贺菌CMCC(B)51252，福氏志贺菌CMCC(B)51572，均呈阳性，其他肠杆菌科和非肠杆菌科实验菌株均呈阴性。检测结果表明该HDA方法对于志贺菌具有较好的特异性。

图 3

注: M: DNA Marker;1:空白对照;2: 5.1×106 cfu/mL;3: 5.1×105cfu/mL;4: 5.1×104 cfu/mL;5: 5.1×103 cfu/mL;6: 5.1×102 cfu/mL;7: 5.1×101 cfu/mL;8: 5.1×100 cfu/mL。 图 3 不同稀释度CMCC(B)51592DNAHDA方法检测电泳图谱

由计数结果可知，各梯度DNA对应菌浓度为: 5.1×10⁶、 5.1×10⁵、 5.1×10⁴、 5.1×10³、 5.1×10²、 5.1×10¹、 5.1×10⁰ cfu/mL。电泳结果显示，随着模板浓度的降低，条带逐渐变淡，至稀释度5.1×10² cfu/mL时无扩增产物，HDA方法的最低检测限为5.1×10³ cfu/mL。

图 4

注: M: DNA Marker;1:空白对照;2: 5.1×106 cfu/mL;3: 5.1×105cfu/mL;4: 5.1×104 cfu/mL;5: 5.1×103 cfu/mL;6: 5.1×102 cfu/mL;7: 5.1×101 cfu/mL;8: 5.1×100 cfu/mL。 图 4 PCR 方法检测不同稀释度CMCC(B)51592DNA的电泳图谱

由各梯度DNA对应的菌浓度及电泳结果可见，普通PCR方法的最低检测限为5.1×10³ cfu/mL。由此可以看出，本研究所建立的HDA方法的灵敏度与普通PCR方法的灵敏度相当。

HDA检测方法有一步法和两步法2种反应程序^〔4〕，Vincent等^〔3〕经过试验比较发现，一步法反应程序的产物比两步法反应程序的产物低40%～60%。本研究采用的是两步法反应程序。Buysse等^〔5〕发现志贺菌含有特有的侵袭性质粒抗原H(invasive plasmid，ipaH)，该抗原在志贺菌不同菌种间具有一定的保守相似性，同时多拷贝存在于染色体和侵袭质粒上，且不随传代丢失。在本研究中选取侵袭性质粒抗原H基因序列作为检测靶基因。在方法建立过程中，对反应温度和反应时间进行了优化;采用近源及非近源共21株菌株进行了特异性验证;在灵敏度方面与普通PCR方法进行了对比。结果表明。所建立的Shigella的HDA检测方法具有较高的特异性和灵敏度。同时所建立的Shigella的HDA检测方法在操作的简便性和检测的快捷性上还存在不足，本研究的下一步工作将对此进行改进，使HDA检测方法基本适合现场快速检测的需要。

现有的实验室检测方法中，传统的细菌培养和生化鉴定方法^〔6〕、酶联免疫技术^〔7〕、 PCR ^{〔8, 9〕}及荧光定量PCR技术^{〔9, 10〕}等方法均存在各自的不足，难以普及应用。HDA技术诞生以后，Chow等^〔11〕利用tHDA(thermostable HDA)技术对引起腹泻的艰难梭状芽孢杆菌进行了检测;Gill等^〔11〕建立了tHDA-ELISA方法对临床样品中的幽门螺旋杆菌进行了检测;美国NEB公司已经开发出一系列基于HDA技术的反应试剂盒^〔11〕，展现出良好的发展势头。随着商品化解旋酶种类的增多和技术的进一步完善，HDA检测方法有望成为一种常规检测手段。