虫媒病毒(arbovirus)是指通过吸血节肢动物叮咬敏感脊椎动物而引起的自然疫源性疾病及人兽共患病的一组病毒。主要集中在披膜病毒科甲病毒属、黄病毒科黄病毒属、呼肠孤病毒科和布尼亚病毒科，以黄病毒属病毒对人类危害最大。与人类疾病相关的黄病毒约40多种^〔1〕。目前，黄病毒鉴定金标准是病毒分离，但因其操作繁琐、技术难度大、耗时长，在实际工作中难以推广应用^〔2〕。近年来应用广泛的常规反转录PCR(retro-transcription-PCR，RT-PCR)及实时荧光定量PCR(real-time PCR)在病毒检测方面显示了快速、敏感巨大优势^〔3〕。但目前使用的RT-PCR、实时荧光PCR大多是针对某一种虫媒病毒的检测^{〔4, 5, 6〕}。本研究利用TaqMan探针荧光定量RT-PCR技术，建立一种快速筛选黄病毒属病毒方法，为国境口岸虫媒病毒检测提供方法学支持。

黄热病疫苗、乙脑病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)毒株MB090509(2.9×10⁴噬斑形成单位(plaqueforming unit，PFU)/mL)、乙脑疫苗、版纳病毒(Banna virus，BAV)毒株、基孔肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)毒株(中国检科院卫生检疫所)，盖塔病毒(Getah virus，GETV)毒株、巴泰病毒(Batai virus，BATV)毒株、登革病毒(dengue virus，DENV)毒株1 ～4型(中国疾病预防控制中心病毒病所)。

TaqMan RT-PCR试剂盒(美国AppliedBiosystems公司);QIAGEN^® OneStep RT-PCR Kit、QIAamp Viral RNA Mini Kit(美国QIAGEN公司);7500荧光定量PCR仪、2720常规PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

从GenBank中检索黄病毒属黄热病毒、JEV、DENV及西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)代表株全基因序列，通过DNAstar软件进行序列比对和保守序列分析。用Beacon Designer 7.0软件设计属特异引物和Taq-Man探针。设计多对黄病毒属特异性引物和探针，进行Blast分析，验证其属内广谱性和特异性。引物、探针由美国Invitrogen公司合成并标记，探针5'、3'端分别标记荧光报告基团荧光素(FAM)和非荧光淬灭基团BHQl，扩增片断为113bp。黄病毒属通用引物: Fla上游: 5' CAACATGATGGGRAARAG3'，Fla下游: 5' CHAGRGCTTCRAACTCHAG3'，通用探针Fla-P: 5' FAM-CTCCVAGCCACATGTACCATAT-BHQ1 3'。

用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取滴度为2.9×10⁴ PFU/mL的JEV毒株MB090509 RNA，具体操作按试剂盒说明书进行。

(1)反应条件优化:以稀释度为10^-3的JEV毒株MB090509 RNA为模板，根据试剂盒推荐引物、探针浓度，试验3种温度:逆转录反应条件为45 ℃ 15 min，95 ℃热启动10 min，40次PCR循环为95 ℃ 10 s→(54/56/58)℃ 45 s;每个反应管中各种试剂加样量分别为2倍缓冲液12.5 μL，10 μmol/L引物各1μL(终浓度400 nmol/L)，10 μmol/L探针Fla-P 0.5 μL(终浓度200 nmol/L)，25×RT-PCR酶混合物1 μL，模板RNA 5μL，用水补足至25 μL。通过扩增曲线与Ct值分析确定最佳退火延伸温度。(2)引物和探针浓度优化:根据试剂盒提供的适宜引物探针浓度，共设计3个浓度梯度并按上述程序扩增。25 μL反应体系中分别加入终浓度为200、400、800nmol/L引物和探针。通过扩增曲线分析确定最佳引物和探针浓度。

将滴度为2.9×10⁴ PFU/mL的JEV毒株MB090509的RNA进行10倍系列稀释，从10⁰到10^-9，相当于病毒滴度从2.9×10⁴ PFU/mL到2.9×10^-5 PFU/mL。用相同模板同时用常规RT-PCR和上述优化TaqMan探针荧光定量RT-PCR进行核酸检测。

将滴度为2.9×10⁴PFU/mL的JEV毒株MB090509的RNA进行10倍系列稀释，从10^-1到10^-7，每个滴度重复检测3次。RNA检测结果由软件自动生成标准曲线，根据“E=10^-1/斜率，%效率=(E-1)×100%”计算扩增效率。

取JEV毒株MB090509的RNA的10^-1、10^-3、10^-6 3个稀释度，每个稀释重复检测4次，计算其均值及标准差和变异系数。

用优化后方法检测黄病毒属JEV、YFV、DENV 1～4型及甲病毒属GETV、CHIKV，布尼亚病毒属BATV，东南亚十二节段RNA病毒属BAV。

用优化方法检测现场蚊虫标本，蚊虫标本参照文献〔2〕处理，提取RNA。将检测阳性的标本研磨液上清接种BHK21细胞，分离病毒。

本研究中试验了3种退火延伸温度，结果均可见明显特异性扩增曲线，为保证引物的最高扩增效率，最后确定反应条件为: 45 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min，95 ℃10 s→54 ℃ 45 s，40次循环。

终浓度分别为200、400、800 nmol/L的引物和探针对扩增效率并没有明显影响，最后确定引物和探针的终浓度为200 nmol/L。

图 1

注: 1-10:病毒RNA稀释度分别为: 100～10-9;11:空白对照;M: DL2000 marker。 图 1 乙脑病毒毒株MB090509RNA系列稀释RT-PCR扩增

选择病毒滴度从2.9×10⁴～2.9×10^-5 PFU/mL，同时用常规RT-PCR和优化后方法进行核酸检测。常规RT-PCR扩增产物凝胶电泳可见阳性扩增条带的最大稀释度为10^-5，敏感性为2.9×10^-1 PFU/mL;而Taq-Man探针荧光定量RT-PCR显示稀释度为10^-7时仍有明显扩增曲线，Ct值为35.2，确定本方法检测限为10^-7，即该方法敏感性为2.9×10^-3 PFU/mL，比常规RT-PCR方法高100倍。根据从10^-1到10^-7共7个稀释度得到标准曲线回归方程为: Y=-3.27 lgX+27.86，R²值为0.998，PCR扩增效率为102.2%。

10^-1、10^-3、10^-63个稀释度JEV毒株MB090509的RNA重复检测4次，模板稀释度为10-1时Ct值分别为16.18、16.00、15.76、16.11;稀释度为10-3时Ct值分别为21.73、22.25、22.01、22.03;稀释度为10-6时Ct值分别为31.27、31.87、31.78、31.89。3组稀释度变异系数分别为1%、0.9%、0.9%。

YFV、JEV、DENV 1～4型样品检测显示Ct值＜ 37，且有明显扩增曲线，而CETV、CHIKV、BATV、BAV Ct值＞ 37或未检出。

用优化方法检测现场蚊虫标本161份，其中11份Ct值＜ 37，为阳性。11份标本均导致BHK21细胞连续3代产生病变，病变细胞上清经RT-PCR扩增、测序，与JEV毒株同源性均在98% ～，证实为JEV。

黄病毒属是主要的蚊传虫媒病毒。随着国家贸易和旅游业发展，出入境交通工具和货物激增，随之而来的媒介蚊虫数量及其可能携带的虫媒病毒潜在危害也在加大。在监测入境蚊虫同时，监测可能携带的虫媒病毒是防控传染病输入的重要措施。作为虫媒病毒重要成员，黄病毒属种类众多，如何在最短时间内检测到更多种类黄病毒，成为国境口岸虫媒病毒监测的主要任务之一。

本研究应用TaqMan探针法建立了针对黄病毒属的实时荧光PCR方法。通过对黄病毒属YFV、JEV、DENV及WNV等30余个毒株的序列分析比对，选择核苷酸高度保守的NS5作为靶序列，设计了多对引物和探针，经过优化最终确定了具有较高特异性引物和探针，黄热病疫苗、乙脑疫苗、登革病毒减毒株1-4型及乙脑病毒毒株检测结果均为阳性，而同为蚊传虫媒病毒的甲病毒、布尼亚病毒和东南亚十二节段RNA病毒均为阴性。敏感性为2.9×10^-3 PFU/mL，比普通RT-PCR高100倍，比SYBR Green法荧光定量PCR高2倍^〔7〕。也有文献报道应用基因芯片检测黄病毒属病毒^〔8〕，但基因芯片方法对仪器要求高、试剂耗材昂贵，不适合基层及国境口岸快速检测。

本研究结果显示对高、中、低3种浓度病毒RNA检测，每个浓度Ct值变异系数均≤1 %，表明该方法具有良好重复性，应用本方法对现场蚊虫标本携带黄病毒进行检测，共检出11份阳性标本，经病毒分离及测序，确定11份标本均为乙脑病毒，表明本方法在现场标本黄病毒筛查中具有应用价值。