卵泡抑素(follistatin，FS)最初是从猪和牛卵泡液中分离获得的具有抑制垂体前叶腺细胞分泌卵泡刺激素分泌作用的单链糖蛋白，近年研究发现FS在组织中广泛表达，如卵巢、垂体、肾及肝脏有高水平表达，在肺脏也有低水平表达，具有多种生物学作用^{〔1, 2〕}。FS一个重要功能是作为激活素(activin)结合蛋白，抑制激活素与其细胞膜表面受体结合，从而抑制激活素作用^{〔3, 4〕}。FS与多种肿瘤形成有关^〔5〕，但FS与肺肿瘤的关系至今仍不明确。为明确FS与肺部最常见的肺腺癌关系，本研究利用免疫细胞化学染色方法检测人肺腺癌细胞FS表达变化，并进一步探讨FS在肺腺癌细胞增殖和凋亡中作用。

鼠抗FS单克隆抗体(吉林大学白求恩医学院免疫学实验室制备)，抗体经protein A蛋白亲和层析纯化。激活素A(美国R＆D公司)。肺腺癌细胞(吉林大学白求恩医学院免疫学实验室保存)，用10%胎牛血清1 640培养液，5% CO₂、37 ℃培养，传2～3代细胞处于对数生长期用于实验。Epoch超微量微孔板分光光度计(美国BioTek公司)。FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)。Cell counting-kit-8细胞计数试剂盒(日本Dojindo公司)。

细胞用4%多聚甲醛固定过夜，浸入到0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer solution，PBS)中漂洗3次，加入3% H₂O₂^-甲醇液处理30 min，PBS漂洗3次。0.3% Triton X-100渗透细胞膜15 min，PBS漂洗3次。滴加2%牛血清白蛋白，室温湿盒中封闭30 min。滴加鼠抗FS单克隆抗体，湿盒内4 ℃孵育过夜，PBS洗3次。二氨基联苯胺显色，苏木精染料复染，常规梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，树胶封片，光学显微镜观察结果。对照采用正常鼠IgG替代抗体染色。每组3个平行样，相同实验重复2次。

肺腺癌细胞接种于96孔细胞培养板(2×10⁴个/孔)，用10%小牛血清-1640培养液，37 ℃、5% CO₂培养24 h，待细胞稳定贴壁后先加入抗FS单克隆抗体至终浓度为1 μg/mL，2 h后加入激活素A终浓度为0、10、20、30、40、50 ng/mL，继续培养24 h后检测细胞增殖，按试剂盒操作说明进行，采用Epoch超微量微孔板分光光度计测吸光度值(A 570nm)代表细胞增殖能力。每组细胞设3个复孔，相同实验重复2次。

肺腺癌细胞用含10%小牛血清RPMI-1 640培养液调细胞浓度至5×10⁵个/mL，加入12孔细胞培养板(1 mL/孔)，待细胞稳定贴壁后先加入FS抗体至终浓度为1 μg/mL，2 h后加入激活素A至终浓度为0、10 ng/mL，继续培养24 h，收集细胞，采用FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡率^{〔6, 7〕}。每组细胞设3个复孔，相同实验重复2次。

所得数据用x±s表示，采用SPSS 10.0软件以t检验进行组间统计学差异分析，P ＜ 0.05认为差异具有统计学意义。

图 1

图 1 肺腺癌细胞中FS表达(免疫细胞化学染色，×200)

利用抗FS单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，正常鼠IgG作为同种型对照染色，图 1可见FS在肺腺癌细胞中表达。

结果显示40、50 ng/mL激活素A组肺腺癌细胞增殖(吸光度A值)分别为(0.49±0.07)、(0.42±0.08)，明显低于对照组(0.62±0.09)(t=2.79、4.07，P ＜ 0.05);而10 ng/mL激活素A组肺腺癌细胞增殖为(0.60±0.09)，与对照组比较，无明显差异(P ＞0.05)。如果预先用1 μg/mL抗FS单克隆抗体中和内源FS后，再加入10 ng/mL激活素A也能抑制肺腺癌细胞增殖(0.48±0.06)，与单纯10 ng/mL激活素A组比较，差异有统计学意义(t=2.717，P ＜ 0.05)。

图 2

注: A.阴性对照组;B.10 ng/mL激活素A组;C.抗FS抗体与激活素A联合组 图 2 流式细胞术检测肺腺癌细胞凋亡

单纯10 ng/mL激活素A对肺腺癌细胞几乎没有诱导凋亡作用，但事先给予抗FS单克隆抗体中和内源FS后，再给予10 ng/mL激活素A则能明显诱导肺腺癌细胞凋亡，早期凋亡率(24.8±6.8)%，与对照组凋亡率(6.7±2.9)%和单纯10 ng/mL激活素A组(7.3±2.4)%比较，差异均有统计学意义(t=5.99、5.94，P ＜0.01)。

激活素A(activin A)属于转化生长因子β超家族的多功能生长分化因子，具有广泛生物学活性，可诱导多种癌细胞凋亡^{〔8, 9〕}。FS是一种特异性激活素结合蛋白，FS与激活素A的亲和力高于激活素受体与激活素A的亲和力，因此，FS可以通过与激活素受体竞争结合激活素A，抑制下游信号传导，阻断其生物学作用。FS与激活素A在多种组织器官中共同表达，两者的平衡是维持机体正常生理机能的重要因素^〔10〕。有研究显示激活素A能够诱导人肺癌细胞系A 549细胞凋亡，添加FS能够减弱激活素A对A 549细胞的凋亡诱导作用^〔11〕。本研究结果显示人肺腺癌细胞可以表达FS，高浓度激活素A可明显抑制肺腺癌细胞增殖，但若事先加入抗FS抗体中和肺腺癌细胞分泌的内源性FS，则低浓度激活素A也能明显抑制肺腺癌细胞增殖，能明显促进激活素A诱导肺腺癌细胞凋亡作用。提示肺腺癌细胞分泌的FS可能通过抑制激活素A诱导肺腺癌细胞凋亡作用，促进肺腺癌的生存及生长。

肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤，近年来死亡率不断攀升。肺腺癌是肺癌中最为常见的病理类型，有效治疗手段是提高治愈率、生存率关键。作为激活素特异结合的FS，其在肺腺癌细胞的表达可能有利于肺腺癌细胞的生存，因此，如果能够抑制FS表达或阻断其作用，对临床治疗肺腺癌可能具有重要意义。