姜黄素(curcumine)是从中草药姜黄(Curcuma aromatica)中提取的一种酚性食用色素。可溶于甲醇、乙醇、碱、醋酸、丙酮和氯仿等有机溶剂。姜黄素具有抗炎、抗氧化、调脂、抗感染、抗肿瘤等广泛药理活性,且毒性低、不良反应小^{〔1, 2〕},姜黄素分子中酚羟基使其具有较强抗氧化作用,姜黄素是含有许多功能基团的独特抗氧化剂。近年来国内外科学家以姜黄素为先导,设计、合成和表征了大量姜黄素结构衍生物和类似物^〔3〕。甲醛是确认的人类致癌物,是室内主要空气污染物之一,并可引起细胞氧化损伤,免疫毒性,致敏作用等^〔4〕。姜黄素对甲醛毒性是否具有拮抗作用,目前尚不清楚。本研究以A549细胞(人类肺肿瘤细胞)作为实验材料,探讨姜黄素对甲醛致细胞氧化损伤拮抗效应。

A549细胞株(人类肺肿瘤细胞)(中国科学院上海细胞库)。姜黄素(美国Sigma公司),以少量二甲基亚砜(DMSO)融解,配置成1g/mL溶液,置于-4℃保存。临用时,以完全细胞培养液稀释到所需浓度,DMSO终浓度< 0.1%。甲醛溶液(美国Sigma公司),改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle media,DMEM)细胞培养液、青链霉素双抗、胰酶(美国Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青公司),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。MCO-15AC型二氧化碳培养箱(日本SANYO公司),CKX31型倒置显微镜(日本Olympus公司)。

将A549细胞置于含10%胎牛血清、100 U双抗DMEM培养液中,于37℃、5% CO₂培养,每2~3 d传代1次。在细胞生长至对数生长期时进行实验。分别于培养12、24、48 h,采用噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)比色法测定A549细胞生长存活率。姜黄素对A549细胞生长抑制实验设对照组、姜黄素2.5、5.0、10、20 mg/L组;姜黄素拮抗甲醛损伤作用实验设对照组、甲醛染毒组(0.1 mmol/L)及5个剂量姜黄素组(甲醛0.1 mmol/L+姜黄素2.5、5.0、10、20、40 mg/L)。

将A549细胞接种至6孔培养板,每孔2 mL,在37℃、5% CO₂,饱和湿度培养至80%融合,弃去培养液,用D-Hanks液洗2遍,姜黄素各组分别加入相应浓度姜黄素,对照组和甲醛染毒组加入DMEM培养液,均置于37℃,5% CO₂,培养12 h,姜黄素各组及甲醛染毒组分别加入0.1 mmol/L甲醛,置于37℃,5% CO₂,培养4h。每组设3个复孔,同一实验重复3次。终止培养后,根据试剂盒说明书进行SOD、NOS和GSH-Px活性与MDA含量测定。

实验数据均以珋 x±s表示,采用SPSS 11.0统计分析软件进行数据处理,组间比较采用t检验,检验水准α=0.05。

表 1

表 1 姜黄素对A549 细胞生长抑制作用( %)

表 1 姜黄素对A549 细胞生长抑制作用( %)

姜黄素超过一定剂量后也能明显抑制细胞生长。正常A549细胞生长活跃,经2.5、5、10、20 mg/L姜黄素处理12~48 h后,细胞生长受到不同程度抑制,呈时间-剂量关系。

对照组细胞呈不规则状,细胞膜完整,细胞核明显,核膜清晰。甲醛染毒组细胞膜表面不规则,有皱缩,细胞膜有损伤,核周间隙增大。10 mg/L姜黄素组细胞损伤减轻,核仁明显,20 mg/L姜黄素组细胞膜皱缩轻微,细胞膜基本完整,核周间隙不大。

表 2

表 2 姜黄素对甲醛致A549 细胞损伤拮抗作用( x±s，n = 3)

表 2 姜黄素对甲醛致A549 细胞损伤拮抗作用( x±s，n = 3)

甲醛染毒组MDA含量高于对照组(t=-13.236,P < 0.05),与甲醛染毒组比较,姜黄素各组MDA含量明显下降(t=7.996~21.278,P < 0.05),40.0 mg/L姜黄素组MDA含量与对照组无明显差异。甲醛染毒组SOD、NOS、GSH-Px活性低于对照组(t=12.103、16.283、12.805、P < 0.05),与甲醛染毒组比较,姜黄素各组SOD (t=-3.462~-20.731,P < 0.05)、NOS (t=-2.938~-19.8,P < 0.05)活性明显升高。

甲醛是一种有毒物质,国际癌症研究中心已将其列为确认人类致癌物质^〔5〕。甲醛也是一种氧化剂,进入机体后产生大量氧自由基,MDA是细胞膜脂质过氧化最终分解产物,SOD和GSH-Px是体内广泛存在的2种抗氧化酶,因此常用作组织脂质过氧化损伤程度参考指标^〔6〕。姜黄素分子中酚羟基具有较强抗氧化作用。Miriyala^〔7〕认为姜黄素抗氧化活性归因于酚基团和甲氧基团与1,3-二酮结合的双烯系统连接。还可明显降低由尼古丁引起的脂质过氧化伤害,对预防因吸烟引起的各种疾病有一定作用^〔8〕。本研究结果显示,经0.1 mmol/L甲醛染毒4 h,细胞膜有皱缩现象,表明甲醛可以直接损伤A549细胞,与已往研究一致^〔9〕。

本研究结果表明姜黄素可拮抗甲醛致A549细胞脂质过氧化毒性作用,使MDA含量下降,SOD、NOS、GSH-Px活性上升,提示姜黄素能够降低甲醛对A549细胞毒性。姜黄素通过减少氧化,增强抗氧化物的活力,从而抑制甲醛对细胞的氧化损伤作用。研究发现^{〔10, 11, 12〕}姜黄素20 μmol/L能够有效提高细胞SOD和GSH-Px活性,姜黄素可拮抗鱼藤酮致PC12细胞氧化损伤,可以拮抗水华微囊藻毒素致动物肝氧化损伤。与本研究结果一致。但其拮抗作用机制目前仍不十分清楚,有待进一步研究。