肺癌是一种严重威胁人类健康的疾病,已成为人类癌症死亡的主要原因,也是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤之一^〔1〕。由于肺癌早期无明显临床症状,80%的患者确诊时已到晚期,因而丧失了最佳治疗时机,5年生存率不到15%^〔2〕。因此,提高肺癌患者早期诊断率,争取早发现、早诊断、早治疗,已成为提高疗效、降低死亡率、延长生存期、改善患者生活质量的关键。近年来,肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)日益成为肺癌早期诊断研究领域的热点,许多新的TAA陆续被发现,它们在肺癌早期诊断、治疗和预后判断方面均有一定价值^〔3〕。选择其中一些对肺癌敏感性和特异性相对较高的肿瘤标志物,组成肿瘤标志物群(TAAs),及其微阵列组合,可用于肺癌的早期诊断^{〔4, 5〕}。为了探讨不同TAAs微阵列组合用于肺癌早期诊断的可行性,提高肺癌患者的早期诊断率。本研究选择12种TAAs,应用ELISA方法,检测了肺癌患者及健康体检者血清中12种TAAs的抗体。现将结果报告如下。

肺癌患者174例,其中男性109例,女性65例,年龄35~84岁,平均(62.6 ± 11.7)岁。患者血清及临床资料分别来自郑州大学第一附属医院检验科(89例)和大连市中心医院检验科(85例)。肺癌的诊断采用统一标准:均为在医院首次就诊并且经组织病理学检查确诊为肺癌的患者。健康对照者92人,来自郑州蓝天健康体检中心,其中男性38人,女性54人,年龄19~76岁,平均(50.6 ± 15.1)岁,所有对照者均经健康体检被证实为无任何肺部相关疾病。

12种肿瘤相关抗原p62(癌蛋白)、cyclin E (细胞周期蛋白E)、cyclin B1(细胞周期蛋白B1)、Imp1(胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白)、p16(肿瘤抑制蛋白)、Sui1(蛋白翻译起始因子)、survivin (细胞凋亡抑制蛋白)、Calnuc (钙离子结合蛋白nucleobindin-2 precursor,Calnuc)、C-myc (癌蛋白)、p53(肿瘤抑制蛋白)、cIAP1(细胞凋亡抑制蛋白)、RalA (V-ral simian leukemia viral oncogene homolog A)(美国德克萨斯州大学生命科学系肿瘤免疫与肿瘤分子流行病学研究室馈赠)。HRP标记的羊抗人IgG (H+L)(美国Stratagene公司);四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢尿素、明胶(美国Sigma公司)。96孔酶标板(美国Gibico公司);SUNRISE自动酶标仪(美国Tecan公司)。

所有血清标本均经患者和健康体检者本人知情同意后,由医院检验科和健康体检中心工作人员采集,郑州大学公共卫生学院肿瘤流行病学重点实验室人员收集分装。所有血清标本均采集5~10 mL全血后加入抗凝剂,室温下放置2 h,然后在1 000 r/min离心15 min后取上清,-80℃保存,避免反复的冷冻解冻过程。

采用ELISA测定血清中12种TAAs的抗体^〔6〕。将12种抗原分别用包被液稀释成0.5 μg/mL的终浓度,包被96孔酶标板,每孔100μL,4℃放置24 h后,弃去包被液;用3%的明胶封闭液封闭后,37℃湿盒加热孵育2 h,弃去孔中封闭液,用加Tween20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)液洗板3次,每次3 min;每孔加入用磷酸盐缓冲溶液(PBS)液按1:100比例稀释的血清标本100μL,37℃湿盒加热孵育1 h,弃去孔中溶液,用PBST洗板3次,每次3 min;每孔加入用PBS液按1:4 000比例稀释的羊抗人IgG 100 μL,37℃湿盒加热孵育1 h,弃去孔中溶液,用PBST洗板3次,每次3 min;加入四甲基联苯胺-过氧化氢尿素显色液,每孔100 μL,37℃湿盒加热、避光显色15 min后,加入终止液50 μL终止显色反应,用SUNRISE自动酶标仪与450 nm处测定吸光度值(A),用空白孔调零。观察比较每种单一TAAs的抗体阳性率、灵敏度等指标;以单一TAA检测结果中灵敏度最高的抗原作为第1种组合,并按灵敏度由高到低每次加入1种TAA进入微阵列组合中,共设立12种微阵列组合,进行并联试验。

血清样品每份做2孔,取平均值判断结果,用空白孔调零;选择正常血清11份和肺癌患者血清2份,作为判断每批ELISA试验的可靠性指标;以92例健康对照者的吸光度平均值加2倍标准差作为判断标准^〔6〕,高于此值者判定为相关抗体阳性。并联试验结果判定,对于每份血清,每种组合中只要有1种抗原的检出结果为阳性,即判断该TAAs微阵列组合检测结果为阳性。应用流行病学中真实性评价指标的灵敏度、特异度、正确指数以及阳性预测值、阴性预测值对各种TAAs及微阵列组合检测结果进行评价,采用受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve,ROC曲线)下面积来评价其诊断价值。灵敏度反映了筛检试验发现病人的能力,灵敏度值越大说明发现病人的能力越强;特异度反映了筛检试验发现非病人的能力,特异度值越大说明发现非病人的能力越强;正确指数:正确指数的范围在0~1,指数越大,真实性越高;阴性预测值:所有阳性结果中真阳性所占比例,即阳性结果的正确率。阴性预测值:所有阴性结果中真阴性所占比例,即阴性结果的正确率。ROC曲线下面积反映了试验的诊断价值的大小,面积越大,越接近1.0,诊断的真实度越高,越接近0.5,诊断的真实度越低,当等于0.5时,则无诊断价值。

采用SPSS 13.0软件进行统计分析,绘制ROC曲线,计算曲线下面积,结果比较采用χ²检验,检验水准为α=0.05。

表 1

表 1 12 种TAA 抗体单一检测阳性率、灵敏度、特异度等比较

表 1 12 种TAA 抗体单一检测阳性率、灵敏度、特异度等比较

结果显示,肺癌患者血清12种TAA的抗体阳性率均高于健康对照者,差异有统计学意义(均P < 0.05),但每种TAA检测的阳性率均不高,灵敏度为12.6%~27.0%,均较低;正确指数为0.111~0.248,均较低,表明单一抗原筛检的真实性比较低;ROC曲线下面积为0.556~0.634,均接近0.5,表明单一抗原抗体的诊断价值均较低。

以表 1中灵敏度最高(27.0%)的Calnuc作为第1种组合,按灵敏度由高到低依每次增加1种TAA加入到微阵列组合中,共设立12种微阵列组合,12种微阵列组合检测结果显示,随着抗原种类增加,从第1种组合到第12种组合的检出抗体阳性率依次上升,并且均高于对照组阳性率(均P < 0.01);灵敏度依次增加,从27.0%上升到72.4%,增加了45.4%;特异度依次降低,从97.8%下降到91.3%,仅降低了6.5%;阳性预测值从95.9%下降到94.0%,只降低了1.9%;阴性预测值从41.5%上升到63.6%,增加了22.1%;正确指数由0.248上升到0.637;ROC曲线下面积由0.618上升到0.819,诊断真实性依次提高。

上述结果显示,第12种TAAs微阵列组合(即包括所有12种抗原)的检测结果最好,肺癌患者血清中TAAs抗体的阳性率为72.4%,与对照组比较(8.7%),差异有统计学意义(χ²=97.74,P=0.000);灵敏度为72.4%,特异度为91.3%,约登指数为0.637,阳性预测值为94%,阴性预测值为63.6%,ROC曲线下面积最大,为0.819,一致率为78.9%,阳性似然比为8.36,阴性似然比为0.302。因此确定第12种TAAs微阵列组合(12种抗原)为最佳组合对早期肺癌的诊断价值较高。

研究表明,肿瘤患者体内存在有各种类型的肿瘤相关抗原,可作为肿瘤早期诊断的标志物^{〔7, 8, 9〕}。本研究对肺癌患者血清中12种TAAs的抗体进行检测,并利用流行病学方法对其诊断肺癌的真实性及其对肺癌的诊断价值进行评价。结果显示,单一TAA的抗体阳性率虽高于健康对照组,提示这些TAAs可以作为肺癌诊断的标志物,但灵敏度均偏低,ROC曲线下面积较小,因此单一TAA检测在肺癌诊断中的实际意义不大。12种不同TAAs微阵列组合的检测结果显示,随着肿瘤相关抗原种类的增加,检测灵敏度不断提高,特异度降低,正确指数和ROC曲线下面积均依次增加。表明TAAs微阵列组合检测用于肺癌早期诊断比单个抗原更有价值,包括12种TAAs的微阵列组合检测可作为肺癌早期诊断的一种方法。

肿瘤相关抗原检测操作简单,而且对肺癌的早期诊断具有颇高的临床应用价值,但需要在一定范围的人群中进一步评价,预期能为肺癌的诊断和高危人群的筛检提供一种准确、快速、实用的方法。今后研究重点应集中在寻找新的特异性和灵敏度较高的的TAAs微阵列组合,从而建立一种新的肺癌早期诊断技术方法。