烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶[NAD (P) H氧化酶]在心血管系统中具有重要作用^〔1〕,研究表明,细胞色素 b245基因(p22phox基因) C242T多态性是冠心病患者中 NAD (P) H氧化酶活性的主要决定因素^〔2〕。近年来有关 p22phox基因C242T多态性与冠心病关系的研究,由于设计和种族等差异结果不尽一致。本研究采用病例对照研究方法,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性基因分型技术,分析比较了早发冠心病、迟发冠心病和正常人群与 p22phox基因C242T多态性的关系。现将结果报告如下。

选取2001年6月-2009年7月在山东大学齐鲁医院心内科确诊的冠心病新发病例746例,年龄30~90岁。 参照文献^〔3〕,以其中男性≤55岁、女性≤65岁患冠心病为早发冠心病,计309例;男性> 55岁、女性> 65岁患冠心病为迟发冠心病,计437例。按年龄段和性别构成比基本匹配,选取在该医院健康体检中心进行体检、无冠心病现病史和既往史的健康人群470人为对照。研究对象之间无血缘关系;所有研究对象均经知情同意后进行问卷调查和采集血样。

采用自行设计调查表进行问卷调查,内容主要包括人口学资料,吸烟、饮酒等情况。体格测量包括身高、体重、血压等,计算体质指数(Body messindex,BMI)。每日吸烟≥1支、持续≥1年者定为吸烟;每周平均饮酒≥3次,每次饮酒折合酒精≥50 mL,持续≥1年者定为饮酒;收缩压≥140 mm Hg或舒张压≥90 mm Hg (1 mm Hg= 0.133 kPa)或有高血压现病史者定义为高血压;BMI≥24定义为超重^〔4〕。

采集研究对象空腹肘静脉血5 mL,其中 4 mL分离血清,用于血脂指标检测;1 mL用5%的乙二胺四乙酸二钠盐按20 μl/mL血液抗凝,用于基因组DNA提取。

采用日立717S全自动生化分析仪和北京中生生物工程高技术公司提供的试剂盒,用酶比色法测定血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)含量。血脂的检测由山东大学齐鲁医院检验科协助完成。

(1)基因组DNA提取:采用常规十二烷基硫酸钠及蛋白酶K消化,酚/氯仿提纯,乙醇沉淀。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法检测C242T基因多态性。(2) PCR引物:上游引物:5'-AACCCTTTGGTGCTTGTGG-3',下游引物:5'-CCTCGGATTTGGAGTGGAT-3'。(3) PCR扩增反应体系:25 μL,其中包括基因组DNA 100 ng,TaqDNA聚合酶2U,Dntp 20 μmol/L,引物各15 pmol/L,MgCl2 20 mmol/L,10 × PCR buffer 2.5 μL。(4)反应条件:94℃ 5min热启动后,94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 60s,30个循环,最后72℃延长5 min。取扩增产物10 μL加入5U RsaI限制性内切酶,37℃水浴过夜,1.2%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下确定基因型。 (5)判定标准:CC为1条带,451 bp;CT为3条带,分别为451、281、170 bp;TT为2条带,分别为281、170 bp。

采用 STATA 9.2软件进行统计分析;任意 2组间计量资料比较采用单因素方差分析，分类变量资料比较以及 Hardy-Winberg平衡检验采用 χ²检验 ;采用单因素 Logistic回归估计基因型比值比( OR)，采用多因素 logistic回归分析调整不同血脂水平 ( TG≥1.7 mmol/L，TC≥5.2 mmol/L)、吸烟、饮酒、高血压、超重等混杂因素;采用双侧检验，检验水准 α =0.05。

(1)早发冠心病组:309例患者中,男性189例,女性120例,性别比为1.58:1。平均年龄(50.62 ±7.43)岁。收缩压(127.52 ± 17.87) mm Hg,舒张压(78.61 ± 11.27) mm Hg,脉压差为(48.92 ±15.18) mm Hg,高血压患病率为44.01%。吸烟率为44.66%,饮酒率为27.51%,超重率为80.58%,血清TG含量为(1.96 ±1.17) mmol/L,血清TC含量为(5.12 ±1.08) mmol/L。(2)迟发冠心病组:437例,男性323例,女性114例,性别比为2.83:1。平均年龄 (68.48 ±7.68)岁。收缩压(131.16 ± 22.16) mm Hg,舒张压 (77.30 ±12.43) mmHg,脉压差(53.87 ±17.60) mmHg,高血压患病率为48.28%。吸烟率为36.01%,饮酒率为17.66%,超重率为64.07%,血清TG含量为(1.52 ±0.86) mmol/L,血清TC含量为(4.98 ±1.20) mmol/L。(3)对照组:470人,男性343人,女性127人,性别比为2.70:1。平均年龄(49.59 ± 8.67)岁。收缩压(131.99 ± 16.50) mmHg,舒张压(83.13 ± 12.81) mmHg,脉压差(48.86 ±10.28) mmHg,高血压患病率为 36.17%。吸烟率为46.67%,饮酒率为61.80%,超重率为 68.72%。血清TG含量为(1.87 ±1.84) mmol/L,血清TC含量为(5.13 ±0.94) mmol/L。早发冠心病组与对照组比较,性别比、收缩压,舒张压,高血压患病率、饮酒率、超重率的差异有统计学意义(P< 0.01或P< 0.05)。迟发冠心病组与对照组比较,年龄、舒张压、脉压差、高血压患病率、吸烟率、饮酒率、甘油三酯均值的差异有统计学意义(P< 0.01或P< 0.05)。早发冠心病组与迟发冠心病组比较,年龄、性别比、收缩压、脉压差、吸烟率、饮酒率、超重率、甘油三酯均值的差异有统计学意义(P< 0.01或P< 0.05)。

图 1

注: 1:为 TT纯合子 ; 4，5，7，11:为 TC杂合子 ; 2，3，6，8，9，10:为 CC纯合子 ; 12: DNA Marker。 图 1 p22phox基因 C242T突变区 PCR扩增 产物 Rsa I酶切电泳结果

成功扩增到与预期数量、大小一致的目的片断。

表 1

表 1 NAD( P) H氧化酶 p22phox基因 C242T基因型和 等位基因频率分布比较

表 1 NAD( P) H氧化酶 p22phox基因 C242T基因型和 等位基因频率分布比较

3组的基因型分布均符合 Hardy-Winberg平衡定律。表 1可见，早发冠心病组、迟发冠心病组 p22phox基因 C242T突变基因型分布和等位基因频率的差异均有统计学意义 ( P_{早发基因型} = 0.023，P_{早发等位基因} = 0.016; P_{迟发基因型} = 0.048，P_{迟发等位基因} = 0.029)。早发冠心病组与迟发冠心病组比较差异均无统计学意义 ( P_基因型 = 0.899和 P_等位基因 = 0.721)。

单因素与多因素logistic回归分析结果显示,与对照组比较,早发冠心病携带CT+TT基因型的个体患冠心病的风险是CC基因型的1.58倍(95% CI=1.07~2.34,P=0.021);经调整性别、舒张压、BMI、TC、TG、吸烟、饮酒后,其OR=1.74(95% CI=1.16~2.62,P= 0.007),差异均有统计学意义。迟发冠心病携带CT+TT基因型的个体患冠心病的风险是CC基因型的1.48倍(95% CI= 1.03~ 2.13,P=0.034),差异有统计学意义,经多因素调整后差异无统计学意义(OR=1.61,95% CI=0.87~2.99,P= 0.130)。与迟发冠心病比较,早发冠心病组携带CT+TT基因型的个体患冠心病的风险是CC基因型的1.07倍(95% CI= 0. 74~1.55,P=0.725);调整后OR=1.08(95% CI=0.73~ 1.59,P=0.715),差异均无统计学意义。

p22phox基因是 NADPH氧化酶的主要组成部分，在产生活性氧的过程中起着重要作用，C242T突变可能通过提高 NADPH氧化酶的活性并参与脂蛋白的氧化而增加血管内的氧化压力^{〔5, 6〕}，这与本研究结果相似，提示 T等位基因是冠心病的危险因素。Nasti^〔7〕在对意大利白人的研究中，发现 276例冠心病患者的 T等位基因频率高于 218名对照 ( 0.400 vs.0.332，P＜ 0.01)，而且，在单血管病变的早发冠心病(＜ 55岁)与迟发冠心病 (＞ 65岁)的比较中，以及在至少 1支冠脉血管阻塞超过 98%与无 1支冠脉血管阻塞超过 98%的冠心病患者的比较中，这种差别更大。提示 T等位基因是冠心病尤其是早发冠心病的危险因素，而且与病情的严重程度相关。 Cahilly^〔8〕对确诊的冠心病患者进行基线冠脉造影后随访 2.5年再行冠脉造影，发现有 C242T突变的患者其最小管腔直径的损失比无该突变的患者高3～5倍，而且其动脉粥样硬化的进展更迅速，恢复更慢。Cai^〔9〕发现在 ≤45岁的人群中，具有该突变的研究对象患冠心病的危险性增高。Macias-Reyes^〔10〕 采用以医院为基础的病例对照研究分析 p22phox基因 C242T突变同冠心病的关系，结果显示，C242T突变在女性人群中是冠心病的危险因素。

早发冠心病和晚发冠心病在遗传背景方面可能存在较大 差异。Nasti^〔7〕研究显示,具有单血管病变的冠心病患者中,年龄< 55岁的患者携带TT/TC基因型的概率(75%)大于年 龄> 65岁的患者(47.9%)。在本研究中,将冠心病人根据患 病年龄划分为早发冠心病和迟发冠心病,2组比较的结果无 统计学意义,可能与年龄的界定不同有关。

有关C242T突变是否是冠心病发病的危险因素目前尚 无定论。不同的研究设计,对疾病定义的不同以及遗传背景 的差异可能是造成结果差异的一个原因。同时冠心病也可能 与多基因遗传因素有关^〔11〕C242T多态性仅仅是一个遗传标 记,还是与冠心病发生相关的因素,以及与冠心病之间的关系 尚需进一步研究。