世界卫生组织认为,如果现行的结核病治疗和预防的方法得不到改进,2000-2020年将另外有10亿人感染结核,其中2亿人将成为活动性结核病患者,3 500万人将死于结核病^〔1〕。目前,从病原分子水平检测感染的暴发、追踪特定结核菌菌株的传播以及揭示感染传播机制等已经弥补了传统流行病学对传播途径和传染源了解不够确切和不深刻的不足^{〔2, 3〕}。本研究利用间隔区寡核苷酸分型的方法对215株结核分枝杆菌临床分离株进行分析,为结核病传染源的追踪、结核病患者外源性或内源性感染的判断、结核病暴发流行调查等方面提供依据。

菌株均来源于甘肃省兰州市肺科医院确诊的肺结核住院或门诊患者痰标本。患者背景资料来源于患者病历，按照统一制作的调查表进行采集。

所用标准菌株 H37Rv 由中国疾病预防控制中心传染病控制所结核室提供。

采用Kamerbeek等推荐的标准 方法操作^〔3〕。利用酚-氯仿法提取DNA,PCR扩增直接重复 区(DR区),所用引物DRa:5'-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3' (5'端进行生物素标记) DRb:5'-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3'。PCR反应条件:96℃变性1 min,55℃退火 1 min,72℃延伸30 s,共35个循环。带有43个间隔寡核苷 酸探针的膜的制备(购自美国Pall公司)^〔3〕,将PCR产物与 固定有探针的Biodyne C膜杂交,洗膜后用CDP-Star检测液 检测(购自英国Amershem公司),经定影显影。

采用 BioNumerics 4. 5 软件进行 Logistic 多元回归分析。

(1)性别年龄分布:所采集菌种的患者 中,男性132例,平均年龄(42.86 ± 17.91)岁,女性患者80 例,平均年龄(38.49 ± 18.49)岁,男女性比例比1.65:1。其 中< 16岁的患者7例(3.26%),16~49岁患者124例 (57.67%),> 49岁患者58例(26.98%)。(2)职业分布:无 业人员61例(28.37%),农民50例(23.26%),学生17例 (7.91%),干部13例(6.05%),司机7例(3.26%),公司职员 6例(2.79%),个体户5例(2.33%),退休人员4例(1.86%),工程师1例(0.47%),出家人(喇嘛)1例(0.47%),其他16例 (7.44%)。

表 1

表 1 215株结核分枝杆菌临床分离株分布情况

表 1 215株结核分枝杆菌临床分离株分布情况

215 例患者中，新发病例120例，复发病例 86例，初治失败患者 2例，7例信息不全 ;有抗结核治疗史患者 181例，无抗结核治疗患者 33例，1例信息不祥 ;规则治疗患者 138例，不规则治疗患者 28例，未经抗结核治疗患者 34例，未知治疗方案患者 15例。

215株结核分枝杆菌可分为 3个基因群 22种基因型，成簇菌株 204株。基因群分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ基因群。Ⅰ群包含 187株，占 86. 98% ( 187 / 215)，分为 7种基因型，其中 1个基因型包含 175株，1个包含 5株，1个包含 3株，有 4个基因型各包含 1株; Ⅱ群包含 3株，占 1. 40% ( 3 /215)，为 1个基因型 ; Ⅲ群包含 25株，占 11. 63% ( 25 /215)，分为 14个基因型，其中包含 2株的有 3个基因型，包含 3株的有 4个基因型，包含 1株的有 7个基因型。基因图谱与国际数据库 ( Spo1DB4)比对，Ⅰ基因群包含的 186株菌，其特点为具有相同的 Spoligotyping指纹图谱，为典型的北京家庭 ( Beijing family)，占总菌数的 86. 51%，其中 175株( 94. 09% )为 ST1，5株( 2. 69% )为 ST190，3株 ( 1. 61% )为 ST621，ST225、ST941和 ST265各 1株( 0. 54% )。 Ⅱ基因群 3株菌株在 SploDB4数据库无相对应的图谱，但根据Spoligotyping 1～ 34间隔区杂交呈阴性反应，35～43至少阳性尽可杂交有 3个定义，可以被确定为 Beijing-like家族，但这种图谱在国际数据库中无报道。Ⅲ基因群中，发现有 T1、T2、T3、MANU2和 H4等基因群。其中 T1( ST53，Shared-type53) 3株、T2 ( ST52 ) 1株、T3 ( ST37 ) 2株、MANU2 ( ST1096) 3株、H4( ST127) 3株。另有 8个基因型 10株菌株数据库中无相应的图谱。以是否为北京家族基因型为因变量，采用 Logistic多元回归分析，结果表明，北京家族基因型与年龄、职业、性别、耐药、新发或复治病例、是否规则治疗、有无治疗均史无关联性。

研究发现兰州地区结核分枝杆菌有以下特点 : ( 1)北京家族基因型菌株是该地区主要流行株，是结核病防治工作的重点。北京家族基因型在亚洲国家非常普遍，在中国香港^〔4〕、马来西亚^〔5〕、越南 ^{〔6, 7, 8〕}均有报道 ;石荔等^〔9〕发现西藏地区 87. 6%的结核分枝杆菌为北京家族基因型。( 2) T1、T2、 T3、MANU2和 H4等基因型结核分枝杆菌成簇出现。H、T、 LAM是非洲、美洲中部、欧洲和南美洲广泛存在的 3个家族。 Brudey等^〔10〕发现 60%的 H4( ST127)分布在亚美尼亚、奥地利、芬兰、美国乔治亚州、伊朗和俄罗斯，在亚洲分布很少。 Jiao等^〔11〕在北京市的结核分枝杆菌中发现了 T1( ST53) 1株 ( 0. 8%)，T2( ST52) 4株( 3. 3% )。MANU是一个来自印度的新发现的家族。本次研究中得到的是 MANU2，当时只存在于印度，提示随着频繁的贸易往来、旅游观光，人群流动性的增多，新的基因型菌种在不同地区开始出现。( 3)北京家族基因型在患者年龄、职业、性别、新发或复治病例、是否规则治疗、耐药、有无治疗史等均无关联性。而越南研究发现，＜ 25岁的患者中北京家族基因型所占比例明显高于＞ 54岁患者^〔7〕。Brudey等^〔10〕利用多元回归分析发现年龄、地区与北京家族基因型有关。甘肃省现有 3万例报告结核病患者，因此进一步进行结核分枝杆菌分子流行病学研究，掌握结核分枝杆菌分子流行病学特征，对有效预防和控制结核病的高发，防止经济欠发达地区因病致贫、因病近贫现象发生具有重要的现实意义。