结核分枝杆菌 ( Mycobacterium tuberculosis，MTB)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。据 WHO报道，全球约有20亿人是结核病的潜伏感染者，约占全世界人口的 1 /3，中国是结核病高负担的 22个国家之一^〔1〕。2006年以来，中国结核病患者的发现递增速度有所提高，全国现代结核病控制策略( DOTS)覆盖率已达 100%^〔2〕。结核杆菌的检测方法主要有细菌学、免疫学和分子生物学等方法。前者虽然是结核病实验室诊断的标准，但涂片检查阳性率低，分离培养耗时较长;分子生物学检查虽快速、灵敏，但技术要求高，推广应用受限。免疫学检测的诊断价值虽不如细菌学检查，但简易、快速并有一定的敏感性和特异性，在高新技术还未应用于临床之前，诊断效果好，操作简便的免疫学检测方法在临床和流行学调查中仍有积极作用。免疫学检测所用抗原的特异性是评价此类方法诊断符合率高低的关键。将多种抗原串联融合，用于联合检测，可在保证特异性的基础上有助于提高检测灵敏度，是研制高特异性和高敏感性诊断试剂的发展方向^〔3〕。本研究选择 ESAT6-38kDa-16kDa作为诊断抗原，酶联免疫吸附试验 ( ELISA )作为检测方法，以脂阿拉伯甘露糖抗原( lipoarabinomannan，LAM )作为对照，观察该蛋白对结核病的诊断价值，现将结果报告如下。

活动性肺结核患者痰检阳性血清 298份，痰检阴性血清 453份，骨结核、肾结核、腹膜结核等肺外结核血清 10份，肺癌、肺炎、支气管炎等非结核病血清 26份(浙江省上虞市疾病预防控制中心 ) ;肺结核患者血清 68份(杭州市红十字会医院)，其中结核蛋白芯片检测抗 38 kDa、16 kDa、脂阿拉伯甘露糖抗体阳性血清 56份，阴性血清 12份;健康体检者血清 500份(浙江省医学科学院门诊部)。

含目的基因 ESAT6-16kDa-38kDa的菌种由浙江省医学科学院寄生虫病研究所新技术开发实验室提供;脂阿拉伯甘露糖( LAM，美国科罗拉多大学 John T Belisle博士提供 )。

辣根过氧化物酶、金黄色葡萄球菌蛋白(浙江省医学科学院寄生虫病研究所新技术开发实验室 ) ;牛血清白蛋白、底物四甲基联苯胺及其他主要生化试剂 (杭州昊天生物技术有限公司)，进口分装或国产分析纯。

将携带重组表达载体的 BL21菌株接种于含卡那霉素 ( kan + ) 50 μg /mL的 Luria-Bertani ( LB)液体培养基，37 ℃振荡培养过夜后，从中取 2 mL，接种于 200 mL新鲜的卡那霉素 LB液体培养基，37 ℃振荡培养 2h，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度 0. 25 mmol/L，37 ℃诱导表达 4h，离心收集菌体，超声破碎菌体，分别收集上清液和包涵体沉淀物。取上述菌体、上清液及包涵体沉淀物，用 100 μL纯水溶解混匀，再分别加入 2×样品缓冲液 100 μL，煮沸 10 min，13 000 r/min，4℃离心 30 min，取 10 μL上清，用于 15%凝胶电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色 2h，脱色3～5 h，观察目的蛋白。经镍离子鳌合亲和层析柱纯化，用洗脱液洗脱吸附在柱子上的蛋白质。分别收集洗脱液 ( 1 mL/管)，取样进行钠十二烷基的硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化效果。合并含重组蛋白洗脱液(电泳鉴定)装入透析袋中，与透析液以 1∶ 100倍的体积置于烧杯中，4℃透析过夜。透析完毕后，用紫外吸收法测定纯化蛋白浓度，公式 :浓度 ( mg /mL) = ( 1.55 × A280 )－( 0.76 × A260 )。低压冷冻干燥冻干重组蛋白，0.5 mg/管分装，－40 ℃保存。

5 mg辣根过氧化物酶，溶解于 0.5 mL蒸馏水中，向溶液中加入 0.5 mL新配的 0. 1 mmol/L的 NaIO4溶液，混匀，4℃静置 30 min;加入 0. 16 mmol/L的乙二醇水溶液 0.5 mL，室温搅拌 30 min;在活化的辣根过氧化物酶中加入含 5 mg抗体的水溶液 1 mL，混匀装入透析袋，pH 9. 6碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜 ;加 0.2 mL新配的 5 mg /mL的 NaBH4液，混匀，再置 4℃2h，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4℃1h; 3 000 r/min离心 30 min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗 2次，最后沉淀物溶于少量 0.15 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中;将上述溶液装入透析袋中，用 0.15 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液透析，去除铵离子后 (用萘氏试剂检测)，10 000 r/min离心 30 min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后－20 ℃保存。

采用滴定法确定抗原、血清和酶标记物最佳工作浓度。用 pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原后包被酶标板，置 4℃冰箱过夜 ;用 pH 7.4磷酸盐 T缓冲液重复洗涤 3次，再加入 200 μL/孔的封闭液 ( 1%牛血清白蛋白 )在 37 ℃湿盒中孵育 1h后，洗涤 3次;加 pH 7. 4稀释液稀释的血清 100 μL/孔，同时在每块板上设阳性对照、阴性对照和空白对照，37 ℃温育 30 min，洗涤 5次;分别向每孔加酶标抗体 100 μL，37 ℃温育 30 min;洗涤 5次后每孔加入显色液( A液、B液)各 50 μL，37 ℃孵育 15 min后，加入终止液终止反应;用酶标仪在 450 nm波长处读取吸光度( A)值; A值大于阴性对照 2. 1倍判定为阳性。

采用 SPSS 13. 0软件进行统计分析，采用 χ2检验进行比较。

图 1

注: 1:低分子量蛋白标准品; 2:空白对照 ; 3:含目的基因的 BL21 ( DE3) pLysE诱导菌 ; 4:超声破碎后上清液; 5:超声破碎后沉淀物; 6:超声破碎后总裂解物; 7:纯化后的目的蛋白。 图 1 重组融合蛋白表达产物的 SDS-PAGE分析

图 1 可见，携带重组表达载体的大肠埃希菌 BL21菌株在 60. 0 kDa左右处有一重组表达的蛋白条带，与预计蛋白分子量相符，故可认为该表达产物为重组蛋白 ESAT6-16 kDa-38 kDa。

表 1

表 1 结核患者血清 ELISA检测阳性率比较

表 1 结核患者血清 ELISA检测阳性率比较

抗原 ESAT6-38 kDa-16 kDa、LAM、血清和酶标抗体的最佳工作浓度分别为 1、 0. 5 μg /mL，1 ∶ 100、1∶4 000。蛋白 ESAT6-38kDa-16kDa和 LAM的敏感性分别为 76. 9%和 77. 4% ;特异性分别为 89. 2%和 89. 5%。

将 ESAT6-38 kDa-16 kDa融合蛋白作为抗原包板，用 ELISA法检测 68份肺结核患者血清，其中 2种方法检测均为阳性 43份，阴性 3份，融合蛋白 ELISA法的检测结果与结核蛋白芯片抗 38 kDa、16 kDa、LAM抗原系统检测结果相似，差异无统计学意义 ( χ² = 0. 018，P＞ 0. 05 )。

结核分枝杆菌有多种分泌性蛋白，其中 ESAT-6为结核分枝杆菌所特有，而卡介苗及非致病分枝杆菌缺乏，且对诊断结核潜伏感染较为有效 ^{〔4, 5, 6〕}; 16 kDa( rPA16)在结核病血清学诊断中与结核菌素试验敏感性和特异性百分比的差异均无统计学意义^〔7〕;而缺乏抗 38 kDa抗体的血清很难与结核杆菌其他抗原发生反应^〔8〕。本研究将本实验室自主表达、纯化获得的融合蛋白 ESAT6-38 kDa-16 kDa作为抗原包板，采用经典 ELISA方法检测的血清学诊断敏感性为 76. 9%，对肺结核痰检阳性病人血清的阳性检出率为 83. 2%，与 LAM比较差异有统计学意义，表明该蛋白用于检测肺结核痰阳患者的检出率较高，对肺结核痰阴性病人和肺外结核病人的阳性检测率相对较差 ;检测 500份健康人血清的阴性符合率为 88. 6%，与蛋白 LAM ( 89. 6% )相差不大 ;检测 26份非结核患者血清的阳性率为 0，与 LAM^〔9〕比较，无交叉反应。表明该重组蛋白有良好的免疫活性。68份肺结核病人血清检测结果无明显差异。表明本室自制的融合蛋白 ESAT6-38 kDa-16 kDa有较好的免疫反应性，可以取代进口产品，有利于降低试剂开发成本，为结核病诊断试剂的开发提供了良好的抗原基础，从而更好的开展结核病的预防工作。

综上所述，本研究所得的融合蛋白 ESAT6-38 kDa-16 kDa不仅对开发结核病临床血清学诊断试剂具有较大的应用价 值，而且对发展新型结核病疫苗也有较大的应用前景 ^{〔10, 11〕}，为本实验对结核病的进一步研究提供了基础。