中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (3): 347-348   PDF    
引用本文
李金平, 侯海峰, 丁国永, 王晶, 王欣农, 李群伟. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对幼鼠关节软骨代谢影响[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(3): 347-348.
LI Jin-ping, HOU Hai-feng, DING Guo-yong, et al. Metabolism and mechanism of articular chondrocytes in young Wistar rats exposed to deoxynivalenol[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(3): 347-348.
脱氧雪腐镰刀菌烯醇对幼鼠关节软骨代谢影响
李金平1, 侯海峰2, 丁国永2, 王晶2, 王欣农2, 李群伟2     
1. 山东省淄博市第一医院预防保健科, 255200;
2. 泰山医学院流行病学研究所
收稿日期: 2011-02-24.
基金项目: 山东省自然科学基金(Y2008C59);山东省教育厅资助(J07E06)
作者简介: 李金平(1985- ),女,山东菏泽人,医师,硕士,研究方向:地方病预防保健.
通讯作者: 李群伟,E-mail:qwli@tsmc.edu.cn
摘要: 目的 观察脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对Wistar幼鼠关节软骨胶原合成和分解代谢的影响.方法 24只健康Wistar幼鼠,随机分为对照组、DON低剂量和高剂量组,低剂量和高剂量组隔日灌胃染毒,处理80 d后,免疫组织化学法检测软骨内Ⅱ型胶原、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)表达;ELISA法检测鼠尿液中脱氧吡啶啉(DPD)含量;电镜观察胶原纤维变化情况.结果 对照组、低、高剂量DON组Ⅱ型胶原表达量分别为(7.42±1.12)%、(4.79±0.96)%、(2.82±0.68)%,组间差异有统计学意义(P<0.05);对照组、低、高剂量DON组iNOS与MMP-13表达量分别为(6.90±1.61)%、(8.52±1.90)%、(11.78±2.51)%和(3.06±1.13)%、(6.45±1.56)%、(12.47±2.45)%,随DON浓度增高而增加(P<0.05);ELISA结果显示,DPD表达量随DON浓度增高呈上升趋势;电镜显示,胶原纤维空隙增大,稀疏,呈老化现象,网络结构破坏较明显.结论 DON可增加软骨细胞iNOS表达,提高NO合成,促进MMP-13合成并增加Ⅱ型胶原降解,进而导致软骨损伤.
关键词: 脱氧雪腐镛刀菌烯醇(DON)     关节软骨     一氧化氮合酶(iNOS)     Ⅱ型胶原     基质金属蛋白酶13(MMP-13)    
Metabolism and mechanism of articular chondrocytes in young Wistar rats exposed to deoxynivalenol
LI Jin-ping, HOU Hai-feng, DING Guo-yong, et al    
Institute of Epidemiology, Taishan Medical College Tai'an 271000, China
Abstract: Objective To examine the expression of collagen type Ⅱ,inducible nitric oxide synthase(iNOS),and matrix metalloproteinase(MMP-13) in articular chondrocytes induced by deoxynivalenol(DON).Methods The young healthy Wistar rats were divided into three groups:normal control,low and high-dosage of DON treatment groups.DON saline solution was injected into stomach of the rat on alternative day.The levels of collagen type Ⅱ,iNOS,MMP-13,and deoxypyridinoline(DPD) were determined by immunohistochemical technique,enzym-linked immunosorbent assay,and transmission electron microscope 80 days after the treatments.Results The content of collagen Ⅱ was 7.43%±1.12%,4.79%±0.96%,and 2.82%±0.68% for the control,low dose DON,and high dose DON group,respectively,with significant differences among the groups(P < 0.05 for all).The level of iNOS and MMP-13 had significant differences among the 3 groups(P < 0.05 for all),with higher levels in low and high-dosage of DON treatment groups compared to that of the control.The level of DPD was increased.The transmission electron microscope observation revealed the damage of collagen network of articular cartilage.Conclusion DON could increase the expression of iNOS in articular cartilage cells and promote the anabolism of mitic oxide,the expression of MMP-13,and the degradation of articular cartilage matrix such as collagen type Ⅱ; all these processes induce the damage of articular cartilage.
Key words: deoxynivalenol     articular cartilage     inducible nitric oxide synthase     collagen type Ⅱ     matrixmetalloproteinase 13    

大骨节病(Kaschin-Beck disease，KBD)是以关节软骨及骺板软骨变性、坏死为主要病理特征的一种地方性骨关节病，研究认为T-2毒素中毒、环境缺硒等与大骨节病发病密切相关〔1, 2〕。但也有认为大骨节病的发生与病区人群的生活因素密切相关〔3〕。研究表明大骨节病病区面粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)含量明显高于非病区〔4〕，动物实验也发现，DON确可导致成年家兔膝关节软骨的病理性损伤〔5〕。与DON同属单端孢霉烯族毒素T-2毒素曾被证实与大骨节病发病有关〔6〕。本研究探讨DON致动物关节软骨损伤的机制及与大骨节病之间可能存在的关系。

1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂

LEICARM2145石蜡切片机(德国Leica公司);IX51倒置式基础型显微镜、Image-Pro Plus 6.0图像处理系统(日本OLYMPUS公司);多聚赖氨酸防脱片、胃蛋白酶消化液(北京中杉公司);DON(美国Sigma公司)用生理盐水溶解;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭液、链霉actividin-生物素(strept actividin-biotin complex，SABC)、二氨基联苯胺(diaminobezidin，DAB)显色剂试剂盒(武汉博士德公司);Ⅱ型胶原蛋白多克隆抗体、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)多克隆抗体、基质金属蛋白酶13(MMP-13)多克隆抗体(英国Abcam公司);二抗(标记长臂生物素，山羊抗兔IgG)(北京中杉公司);尿脱氧吡啶啉ELISA试剂盒(上海BlueGene公司)。

1.2 实验动物

健康雄性SPF级Wistar幼鼠(山东中医药大学实验动物中心)24只，动物许可证号: SCXK(鲁)20050015，20日龄，初始体重:(90.3±7.8)g，所用饲料为山东中医药大学提供，分笼饲养。

1.3 分组与处理

大鼠在饲养3 d后随机分为3组(对照组，低、高剂量DON组)，灌胃染毒，每2d染毒1次，高、低剂量组分别给予0.25、0.06 mg/kg DON，对照组给予相同体积生理盐水，连续80 d，用代谢笼收集各组幼鼠24 h尿液，记录尿量，留尿5 mL为样本，置-20℃下储存，尿脱氧吡啶啉检测采用试剂盒法。采集尿样后，将大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速取右侧膝关节，4%多聚甲醛固定24 h。关节组织经10%乙二胺四乙酸于37 ℃温箱脱钙20 d，常规石蜡包埋。

1.4 石蜡切片免疫组化染色

将0.5 μm石蜡切片常规脱蜡和复水，3%H2O2室温以灭活内源性酶5～10min，蒸馏水洗3次，胃蛋白酶修复液修复抗原，滴加5% BSA封闭液，室温20min，加1: 200稀释的一抗(兔IgG)，4℃过夜，磷酸盐缓冲液洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG(或兔、人IgG)，20～37℃ 20 min。磷酸盐缓冲液(ph 7.2～7.6)洗3次，滴加试剂SABC，20～37 ℃ 20min，磷酸盐缓冲液洗5 min × 4次，DAB显色试剂盒(AR1022)显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染20s。脱水，透明，中型树胶封片。显微镜观察。细胞膜或胞浆染为棕黄色者为阳性。每组中各切片随机选10个视野，高倍镜下用图像分析软件进行图像分析，以IOD值作为Ⅱ型胶原，iNOS，MMP13的相对含量。

1.5 统计分析

采用SPSS 14.0软件进行实验数据的统计分析。定量资料用珋x±s表示，各组间结果比较采用单因素方差分析，并用最小显著差法进行两两比较，以P ＜ 0.05为有统计学意义。

2 结果 2.1 免疫组化检测结果(表 1)
表 1 各组Ⅱ型胶原、iNOS、MMP-13表达

随着DON浓度增高，Ⅱ型胶原的表达量逐渐降低，iNOS、MMP-13的表达量逐渐增高。

2.2 尿脱氧吡啶啉检测结果

对照组、低、高剂量DON组尿脱氧吡啶啉含量分别为(4.85±2.32)、(6.57±2.16)、(17.61±5.92)nmol/L，随DON浓度增高呈上升趋势(F=25.516，P ＜ 0.01);与对照组比较，低、高剂量DON组尿脱氧吡啶啉含量升高(t=5.695、6.582，P ＜ 0.01)，而低剂量组与高剂量组之间的差异无统计学意义(t=0.887，P ＞ 0.05)。

2.3 胶原纤维超微结构变化(图 1)
图 1 各组大鼠关节软骨胶原纤维超微结构(×50000)

电镜显示，对照组胶原纤维排列有序，DON组胶原纤维空隙增大，稀疏，呈老化现象，网络结构破坏较明显。

3 讨论

Ⅱ型胶原是软骨细胞合成的软骨基质中特异性胶原蛋白，Ⅱ型胶原含量反映了软骨细胞和成骨细胞成熟状况，对维持软骨结构和功能有重要作用。研究显示，当Ⅱ型胶原合成或降解代谢异常时，预示着关节软骨，特别是中层软骨细胞过度凋亡、软骨不可逆损伤的发生〔7, 8〕。尿脱氧吡啶啉是近年来新发现的一种胶原末端代谢产物，其含量变化可直接反映骨胶原降解和骨吸收情况〔9〕，本研究结果表明，随着DON染毒剂量的增高关节软骨Ⅱ型胶原表达减少，且尿脱氧吡啶啉的含量也成增加趋势。

近些年发现，MMPs可以使Ⅱ型胶原降解、断裂，在病变部位会有大量的MMPs表达〔10, 11〕。MMP-13是MMPs的一种，主要降解Ⅱ型胶原。本研究结果显示，DON可使软骨细胞内MMP-13的表达增高，进一步增强软骨胶原的降解，从而导致关节软骨不可逆损伤。

研究显示一氧化氮(NO)可抑制软骨细胞增殖，诱导软骨细胞凋亡，导致软骨组织破坏等〔12〕，在体内，NO是由诱导型一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸产生，在细胞因子如白细胞介素-1、肿瘤坏死因子等刺激下产生大量NO〔13〕，本研究结果表明，DON毒素导致诱导型(iNOS)合成增高，进而产生大量的NO，NO可能通过刺激MMPs合成和分泌，引起关节软骨Ⅱ型胶原吸收、降解和破坏。

参考文献
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