细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)对于细胞增殖、分化、内环境稳定及机体新陈代谢、生长发育等生理过程起重要作用。细胞间隙连接是由细胞间隙连接蛋白(connexin,Cx)六聚体形成的跨膜通道结构,细胞间隙连接蛋白是构成细胞间隙连接的蛋白大家族,在人类组织中已经有超过20种细胞间隙连接蛋白被鉴定,connexin43(Cx43)则是该蛋白家族中组织分布最广、研究最多的一个重要成员,主要表达在心肌、肺、平滑肌、晶状体、成纤维细胞、星形细胞等多种组织。各种蛋白激酶及蛋白磷酸酶通过使Cx43蛋白不同氨基酸位点磷酸化和去磷酸化来调控细胞间隙连接通讯,而且Cx43蛋白只有适当磷酸化才能促进细胞间隙连接通讯功能发挥,非适当磷酸化或去磷酸化均能抑制细胞间隙连接通讯功能。本文就Cx43蛋白磷酸化与细胞间隙连接通讯功能关系研究现状综述如下。

细胞间隙连接蛋白是跨细胞膜蛋白质,因其构成相邻细胞之间的膜通道结构-细胞间隙连接而得名。6个相同或相似的跨膜Cx蛋白环绕形成筒状结构,称连接子(connexon),2个连接子在相邻细胞的细胞膜上分别从膜中伸出并对接,组装成亲水性细胞间隙连接通道。由同聚体连接子构成的间隙连接称为同型间隙连接(homotypic junction),由异聚体连接子构成的间隙连接称为异型间隙连接(heterotyoic junction)。由于不同Cx蛋白的同源性主要在细胞外的两个结构域,由此推断Cx家族成员之间细胞结构域的高度保守性能允许成员之间相互作用^〔1〕。但并非所有Cx蛋白成员之间都可以任意形成异型间隙连接,目前被一致接受的是Cx43蛋白可以与Cx37、Cx43、Cx45以及Cx46蛋白形成有功能的间隙连接,但不能与Cx26、Cx31、Cx32、Cx33、Cx40或Cx50蛋白形成间隙连接。间隙连接通道的直径取决于连接蛋白种类,一般约1.5~2 nm,此通道允许分子量小于1.5kD或直径小于1nm的离子或小分子物质,如钠、钾、钙等离子,氨基酸、核苷、第二信使分子、小分子药物、致癌物等通过。

细胞之间通过间隙连接相互沟通信息,使相邻细胞间形成协调的整体组织结构,细胞间的这种相互交流称为间隙连接通讯功能。间隙连接在结构上使细胞间相互连接,在功能上允许各种离子及小分子物质的通过从而介导细胞间电和化学信号传递,协调不同系统和组织之间电导性或代谢来有效地调控各种信息;使相邻细胞之间形成一个整体,从而调控细胞整体功能代谢,增殖分化^{〔2, 3〕}。细胞间隙连接通讯在维持内环境稳定,调节胚胎发育与分化,增强组织对激素的反应以及控制细胞恶性增殖等方面起重要作用^{〔4, 5〕},由于细胞间隙连接通讯功能的正常发挥能够抑制细胞过度生长,因此肿瘤细胞间隙连接也能够抑制肿瘤细胞生长。研究表明,很多肿瘤细胞都出现了Cx蛋白表达下降,导致细胞间隙连接通讯功能下降甚至丧失,使细胞丧失了接触抑制,脱离其他细胞对它的监控^〔6〕。间隙连接通讯介导的细胞间信号异常还可以引起身体各系统疾病,如Samoilova^〔7〕研究表明Cx43蛋白表达的高低与癫痫发生有一定关系,在癫痫形成时,Cx43蛋白表达通常上调。Melchionda^〔8〕等认为Cx26基因突变是遗传性先天性听力丧失的主要原因。

细胞间隙连接通道的功能受多种因素影响,这些因素主要有胞内pH值、Ca²⁺浓度、Cx蛋白磷酸化状态、跨通道电压以及一些神经体液因子。Cx蛋白磷酸化在间隙连接通讯功能的调节中发挥重要作用。正常情况下,Cx蛋白本身存在一定程度磷酸化,这种磷酸化有助于细胞通讯功能正常发挥,磷酸化程度过高或过低都会抑制间隙连接通讯功能。

Cx43蛋白首先在内质网合成,然后转运至高尔基复合体进行修饰,最后转运到细胞膜上聚集形成间隙连接^〔9〕。有报道显示,Cx43蛋白是在反面高尔基网聚合形成连接子,而天竺鼠肝脏的连接子是由Cx26蛋白和Cx32蛋白在内质网和高尔基体中间隔聚合而成^〔10〕。聚合而成的连接子(或半通道)转运至胞膜,相邻细胞的两个半通道对接组装形成间隙连接。正常情况下,这些半通道的功能被严格调控,从而保障细胞间信息的稳定交流。丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶都能够通过磷酸化反应关闭半通道^〔11〕。Cx43蛋白半衰期约为1~3h,意味着Cx43蛋白有较快的更新速度。

正常细胞生命周期中Cx43蛋白发生着不同的磷酸化。LAMPE等人^〔12〕分析Cx43蛋白发现,Cx43蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析中有多个电泳条带亚型,包括1个迁移较快的非磷酸化Cx43蛋白亚型(P0),分子量约为40~42 kD;至少2个迁移较慢的磷酸化亚型(P1和P2),P1代表部分磷酸化的Cx43蛋白,分子量约43~44 kD;P2代表高度磷酸化Cx43蛋白,分子量约46 kD。在使用碱性磷酸酶处理后,电泳结果显示,原P1和P2条带迁移到P0条带位置处,表明磷酸化是主要的共价修饰。

Cx蛋白的C-端肽链包含复杂的磷酸化位点,是发生磷酸化的主要区域,大多Cx蛋白磷酸化主要发生在丝氨酸残基上,而当v-Src基因编码的PP60src蛋白激酶激活时,也可以出现酪氨酸的磷酸化。Cx43蛋白的C-端241~382氨基酸为主要磷酸化区,多种蛋白激酶能够识别该区域内的磷酸化位点,不同位点磷酸化对于间隙连接通道通透性及功能有重要调节作用。

Cx蛋白的磷酸化修饰主要通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同调节完成。一种蛋白激酶可以通过一种或几种作用机制来影响细胞的间隙连接通讯功能。

PKA是一种cAMP依赖蛋白,可以与cAMP结合并被其激活,活化PKA磷酸化Cx43蛋白,Cx43蛋白不同位点的磷酸化对于间隙连接通讯功能影响不同。Yogo等^〔13〕发现由卵泡雌激素诱导的PKA磷酸化大鼠颗粒细胞中Cx43蛋白的Ser365、Ser368、Ser369、Ser373等位点,结果增强了细胞间隙连接形成及通讯功能。TenBroek等人^〔14〕认为PKA磷酸化Cx43蛋白的Ser364位点,能增加间隙连接通道组装。而Bao等^〔15〕发现PKA磷酸化Cx43蛋白的Ser368位点,该位点磷酸化可改变Cx43蛋白构象,降低连接子渗透性,从而使间隙连接通讯功能下调。

PKC在许多细胞类型中通过增强Cx43蛋白磷酸化抑制细胞间通讯^〔16〕。Fernandes等^〔17〕研究发现高糖通过PKC高度磷酸化Cx43蛋白导致其降解,抑制肾小管内皮细胞间隙连接。研究表明,在很多种细胞中,PKC能使Cx43蛋白Ser262位点发生磷酸化,导致Cx43蛋白构象改变,在凝胶中迁移改变,下调间隙连接通讯功能^{〔18, 19〕}。EK-VITORIN等^〔20〕研究发现,PKC高度磷酸化Cx43蛋白的Ser368位点,降低通道选择通透性,降低间隙连接功能。

2004年Gieomans^〔21〕研究了大鼠心肌细胞中cGMP可以激活PKG,而激活的PKG使Cx43蛋白Ser257位点磷酸化,导致细胞间信息传递和对染料的通透性降低。有关PKG磷酸化Cx43蛋白的研究不多,尚需要更深入研究。

MAPK家族包括ERK (extracellular regulated protein kinases)1/2、BMK-1(Big MAP kinase-1,又称ERK5)、p38、JNK (c-Jun N terminal kinase)等成员,是与细胞生长、分化、凋亡等过程密切相关的关键激酶。ERK磷酸化Cx43蛋白的Ser255、Ser279及Ser282位点,减少间隙连接通道开放率,下调通讯功能^〔22〕。但一种具有弱雌激素样作用的环境污染物壬基酚,能通过p38-MAPK途径使Cx43蛋白去磷酸化,从而下调间隙连接通讯^〔23〕。氧化磷脂POVPC能通过MAPK途径增强Cx43蛋白Ser279/282位点的磷酸化促进血管平滑肌细胞生长^〔24〕。

Cooper^〔25〕研究CK1与Cx43蛋白的组装,发现CK1作用于小鼠肾细胞,可直接磷酸化Cx43蛋白的Ser325,328或330等位点,调节细胞膜上Cx43蛋白组装形成连接通道,用CK1抑制剂能使Cx43蛋白在原位点的磷酸化降低,并伴随着Cx43蛋白向细胞膜的聚集减少。LAMPE等^〔26〕研究心肌缺血细胞时,发现心肌缺血能降低Cx43蛋白磷酸化,将Ser325/328/330 3个位点色氨酸突变为丙氨酸后,通道功能明显下降,进一步证明Ser325/328/330位点磷酸化能够影响连接通道组装及连接选择通透性。

Cdc2是一种蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶,细胞周期进程中必不可少。体外研究表明^〔27〕,Cdc2能直接磷酸化Cx43蛋白,作用靶点可能为Ser255或Cx43蛋白的C-末端尾部,并且可能会引起Cdc2下游激酶激活。在有丝分裂期中,Cdc2介导的连接子磷酸化可能降低细胞间隙连接^〔23〕。

Src家族是研究最多的非受体酪氨酸激酶,Src家族成员有3个同源区域:SH1、SH2、SH3,在磷酸化Cx43过程中发挥不同作用。蛋白c-Src蛋白激酶是正常细胞中酪氨酸特异性蛋白激酶,其基因突变后表达的v-Src蛋白激酶则是一种致癌蛋白激酶,Warn-Cramer等^〔28〕认为,v-Src必须同时作用于Cx43蛋白的Tyr265及Tyr247位点才能引起间隙连接通道关闭。

Cx43蛋白上有一系列磷酸化位点,因此也有很多直接作用其上的蛋白磷酸酶(protein phosphatase,PP)。根据磷酸化氨基酸残基的种类可分为蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、蛋白质酪氨酸磷酸酶。

PP1,PP2A,PP2B和PP2C都是苏/丝氨酸蛋白磷酸酶家族成员。Duthe等^〔29〕在缺少ATP的电偶联心肌细胞中发现PP1抑制剂能部分地维持通道活性。PP2B属于钙调蛋白依赖磷酸酶家族,是唯一由第二信使Ca²⁺调控的蛋白磷酸酶,所以又被称为神经钙蛋白。在动物实验中发现,心衰竭的家兔心肌细胞中,PP2A局部含量明显增高,并导致细胞的Cx43蛋白去磷酸化,间隙连接通讯功能下降,而PP1的含量无明显变化^〔30〕,说明此动物模型中PP2A对间隙连接通讯起主要调节作用。Wei等人^〔31〕也发现在低氧的星形胶质细胞中,PP2B抑制剂能减少低氧诱导的Cx43蛋白去磷酸化和连接解偶联。

PTP作为信号转导调节因子,通过去除酪氨酸残基上磷酸基团,可对信号转导产生开关效应^〔32〕,如SHP-1(Src homology-2-containing protein-tyrosine phosphatase 1)在细胞因子信号转导中呈现重要的负向调节,其缺乏将导致酪氨酸持续磷酸化,结果使细胞异常增殖。Giepmans等^〔33〕发现受体蛋白酪氨酸磷酸酶μ(RPTPμ)的磷酸酶结构域能降低过表达的Cx43蛋白,并且RPTPμ与Cx43蛋白能免疫共沉淀,这些数据表明,RPTPμ能抑制Src的磷酸化作用,使Cx43蛋白处在非磷酸化状态,从而阻止通道关闭。

近年来研究表明,Cx43蛋白异常表达与多种疾病密切相关,如心律失常,肿瘤发生等^{〔34, 35〕}。Cx43蛋白磷酸化和去磷酸化是调控Cx43蛋白功能的重要方式,而Cx43蛋白的非适当磷酸化必将影响细胞功能正常发挥,因此,Cx43蛋白磷酸化研究将有助于理解Cx43蛋白与生物特定生命过程的关系,有助于临床疾病诊断和疾病预后判断,甚至为基因靶向治疗提供新思路。Cx43蛋白磷酸化调节非常复杂,可能存在着不同蛋白激酶磷酸化特定的氨基酸位点,也可能存在着特定氨基酸位点被特定蛋白激酶磷酸化的特点,而不同位点磷酸化可能使Cx43蛋白表现出不同功能,如细胞间隙连接通讯功能的开关,甚至特定位点的磷酸化可能使Cx43蛋白参与细胞内信号通路调控,这些都需要进一步的实验研究证实。