脂联素是脂肪细胞分泌的一种蛋白质,具有抗炎、抗动脉硬化及增强胰岛素敏感性等功能^〔1〕。脂联素基因(adipose most abundant gene transcript 1,apM-1)位于染色体3 q 27,全基因组扫描显示,此区域含有2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2 DM)和代谢综合征的易感基因^〔2〕。但由于研究对象种族、遗传背景及生活环境等不同,脂联素基因与T2 DM关联的报道结果并不一致^{〔3, 4〕}。因此,为了进一步探讨脂联素基因多态性与2型糖尿病的关联及其危险因素,本研究于2008年选择四川省凉山州汉族居民,采用病例对照研究方法,探讨了T2 DM与apM-1第2外显子第45位单核苷酸多态性(SNP45)的关联,及T2 DM的危险因素。结果报告如下。

采用分层整群抽样和病例对照研究方法,选择四川省凉山彝族自治州的西昌市、普洛县、喜德县、金阳县、昭觉县和布拖县,对其中≥20岁的汉族居民进行横断面调查,筛查其中的T2 DM患者153例作为病例组;采用频数匹配方法,按年龄和性别匹配,选取调查同期的社区健康人群158人作为对照组。所有入选对象均签署知情同意书。

(1)主要试剂:血脂检测试剂盒(日本和光公司);基因组大量全血DNA提取试剂盒(北京天为时代科技公司);Taq DNA聚合酶(协和医学分子生物学国家重点实验室配制);引物(英骏生物技术有限公司);限制性内切酶SmaⅠ(美国NEB公司);(2)主要仪器:PTC-100 PCR仪(美国MJ Research公司);电泳槽(JY-333)(北京君意机电技术公司);电热恒温水浴箱(DSY-24)(余姚长江温度仪器厂);GAS 7001 B凝胶图像扫描仪(英国UVItec公司)。

(1)问卷调查:采用自行设计的问卷进行调查,内容包括年龄、性别、身高、体重、家族史、吸烟、饮酒、受教育程度、劳动强度、糖尿病家族史等;同时测量身高、体重,计算体质指数(kg/m²);抽取隔夜禁食后静脉血5 mL,分离血清;(2)检测指标:以坐姿测量右上肢肱动脉血压3次,每次间隔1 min,取均值作为血压值;采用酶比色法,于721分光光度计上测定空腹血糖;采用试剂盒法测定总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白;按Freidwaid公式计算低密度脂蛋白。由经过统一培训的调查员进行入户调查并采样。

(1)诊断标准:收缩压≥ 140 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)和/或舒张压≥90 mm Hg或已确诊高血压并治疗者判定为高血压;24.0≤体质指数< 28.0者为超重,体质指数≥28.0者为肥胖;甘油三酯≥1.7 mmol/L为异常,高密度脂蛋白≤0.91 mmol/L为异常,总胆固醇≥5.18 mmol/L为异常,低密度脂蛋白≥3.37 mmol/L为异常;空腹血糖≥7.0 mmol/L或有糖尿病病史判定为T2 DM。(2)劳动强度划分:从事坐位、站位或走动少的工作为轻度;学生、司机或电工等为中度;搬运建筑工人和从事手工农业劳动者为重度。

取现场采集的外周血5 mL,采用大量全血基因组DNA试剂盒提取基因组DNA,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)检测脂联素基因SNP 45。参照文献〔10〕设计引物序列,上游引物序列为:5'-GCA GCT CCT AGA AGT AGA CTC TGC TG-3';下游引物序列为:5'-GCA GGT CTG TGA TGA AAG AGG CC-3'。PCR反应体系25 μL,循环参数为94℃预变性5 min,94℃变性1 min,59℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙化锭染色检测扩增结果。

限制性酶切反应在25 μL反应体系中进行,其中PCR产物10 μL,SmaⅠ限制性内切酶0.3 μL,加ddH₂O补足至25 μL。25℃水浴4 h。酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色,凝胶成像系统拍照并判断基因型,设定空白对照为酶切体系中以双蒸水代替PCR扩增产物,标准对照为经反复酶切反应结果稳定的阳性或阴性标本。

应用SAS 9.1软件进行统计分析,计量资料比较采用t检验;基因型分布和等位基因频率比较采用χ²检验;多因素分析采用非条件Logistic回归。

表 1

表 1 2 组居民基本特征分布比较

表 1 2 组居民基本特征分布比较

病例组153例中,男性76例,占49.67%;女性77例,占50.33%;年龄(52.37 ± 13.10)岁。对照组158人中,男性80人,占50.63%;女性78人,占49.37%;年龄(52.35 ± 12.76)岁。2组性别构成、年龄差异均无统计学意义(P=0.8656,P=0.9901)。病例组体质指数为(24.29 ± 3.57),对照组为(22.33 ± 3.29),差异有统计学意义(P < 0.000 1),2组有糖尿病家族史比较差异有统计学意义。

图 1

注: 1: DNA marker; 2，3 : 标准对照; 4，5 : 空白对照; 6，7 : TG 型; 8: TT 型; 9: GG 型。 图 1 apM-1 Sma I 酶切多态性电泳图谱

SNP 45基因PCR扩增产物长372 bp,经限制性内切酶SmaⅠ酶切后,产生3种基因型:TT (野生型,209、163 bp)、TG (杂合子型,372、209、163 bp)和GG (纯合子突变型,372 bp)。

表 2

表 2 2 组基因型频率与等位基因频率分布

表 2 2 组基因型频率与等位基因频率分布

凉山州汉族居民T2 DM对照组的3种基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡,表明对照人群可以代表一个随机婚配群体。χ²检验结果显示,病例组与对照组基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义。

以是否为糖尿病作为因变量,以糖尿病家族史、体质指数、受教育程度、劳动强度、血压、总胆固醇(TG)、基因型(TT型,TG+GG型)作为自变量引入logistic回归方程。结果显示,体质指数(OR=1.707,95% CI=1.184~2.462,P=0.004 2)和糖尿病家族史(OR=4.626,95% CI=1.655~12.930,P=0.003 5)是凉山州汉族居民T2 DM的危险因素。

西班牙一项病例对照研究显示,GG基因型与T2 DM关联明显^〔3〕;在包括加拿大人、德国人、澳大利亚人、挪威人、丹麦人和瑞典人的研究中,同样发现GG基因型与T2 DM关联^〔4〕,国内亦有研究报道GG基因型是T2 DM的危险因子^〔5〕。但在韩国^〔11〕、中国台湾^〔12〕以及日本^〔13〕等亚洲人中也有T2 DM与apM-1 SNP 45多态性无关联的报道。

本研究结果表明,凉山州汉族居民apM-1 SNP 45 T/G多态性与T2 DM的关联尚不确定。2型糖尿病的发生可能是多个易感基因(微效基因)发生微小突变,并与环境因素共同作用的结果。因此,即使apM-1确实是T2 DM的易感基因,由于基因的微效作用,在以人群为基础的小样本研究中可能得不到有统计学意义的结果^〔14〕。由于现场调查的条件所限,在短时间内很难收集到大量的样本,这也是本研究的局限性所在。所以今后有必要扩大样本量,对研究结果进行进一步的证实。

本研究结果显示,BMI和糖尿病家族史是凉山州汉族居民T2 DM的危险因素。我国11省市的调查发现,糖尿病患病率随着体重的增加而上升,超重者患糖尿病的危险为正常人的2.36倍,而肥胖者达3.43倍^〔15〕。国内外研究均表明糖尿病家族史是T2 DM重要的易感因素^{〔16, 17, 18〕},本研究也显示,有糖尿病家族史者患T2 DM的风险是无家族史者的4.6倍。由以上分析可以推知,通过在社区人群中对有糖尿病家族史、超重和肥胖的人群进行筛查,发现高危人群从而进行有针对性的健康宣教和健康干预等,有望加强T2 DM的预防效果。