金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs) 是金黄色葡萄球菌分泌的一种具有超抗原活性的胞外蛋白毒素，现已发现的肠毒素有大约20 种^〔1〕。与传统抗原不同，超抗原SEs 在极低浓度下即可活化大量T 细胞，并产生多种细胞因子，从而达到增强免疫力和杀伤肿瘤细胞的效果^{〔2, 3, 4, 5, 6〕}。其中金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2) 已被开发为治疗肿瘤的生物制剂应用于临床，并取得了明显疗效^〔7〕。为了获得新型的肠毒素，为临床上提供性能更加优越的抗肿瘤生物制剂，本研究利用分子生物学技术从2 株金黄色葡萄球菌中克隆并原核表达2 种新型SEs，表达的重组蛋白纯化后，对其生物活性和抑瘤效果进行了评价。现将结果报告如下。

(1) 质粒、菌株与癌细胞株: 质粒pGEM-T(美国 Promega 公司) 、pET28a (美国Novagen 公司) ; 大肠埃希菌 JM109、BL21(DE3) (本实验室保存) ; 金黄色葡萄球菌肠毒素 2(SEC2，本实验室纯化制备) 金黄色葡萄球菌SD、104 株(辽宁出入境检验检疫技术中心保存) ; 大肠癌细胞Cx-1(中国医科大学细胞生物学重点实验室惠赠) 。(2) 试剂与仪器: 生化试剂(分析纯) (沈阳禹王化学试剂有限公司) ; RPMI1640 培养基(北京Hyclone 公司) ; 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT) 、胎牛血清(上海生工公司) ; Taq 酶、限制性内切酶(大连TaKaRa 公司) ; 镍离子金属螯合(Ni⁺ -NTA) 亲和层析柱(德国Qiaqen 公司) ; Hanks 液、噻唑蓝溶液(本实验室配制) ; 基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA 片段快速回收/纯化试剂盒(上海生工公司) 。

根据Genbank 中已知金黄色葡萄球菌SEs 基因比对结果，在保守区域设计引物，C1: 5'-AC/TAACAAGTCCAC/ TTTGTAAAT-3'; C2: 5'-CGCGTC/TAAG/CTTGTA/ GTATAAATA-3'。引物由上海生工公司合成。

按照基因组提取试剂盒说明书提取金黄色葡萄球菌基因组，以其为模板，利用引物C1 和C2 扩增SEs 基因，利用胶回收试剂盒回收扩增产物并连入T-A 克隆载体pGEM-T，转化大肠埃希菌感受态细胞并筛选阳性克隆，通过PCR 验证重组质粒并由上海生工公司测序。将测序结果与已知SEs 基因进行比对，根据比对结果找到SEs 的编码基因。

根据连入T 载体的扩增序列的测序结果，分析开放阅读框(ORF) ，搜索SEs 编码基因的 ORF，以此设计引物D1: 5'-AGAATTCAGCGAAGAAATAAATGG-3'; D2: 5'-ACCCTCGAGTTAAGTTGTGTATAAAT-3'，将 EcoRI 和XhoI 2 个酶切位点引入PCR 产物，并分别利用这2 种酶对PCR 产物和表达载体pET28a 进行双酶切，胶回收相应的DNA 片段，连接并转化大肠埃希菌BL21(DE3) 感受态细胞，筛选阳性克隆并进行PCR 鉴定、单酶切、双酶切鉴定和测序。

将包含重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3) 接种于新鲜的Luria-Bertani(LB) 液体培养基中，37 ℃ 培养至吸光度600 nm(A_{600 nm}) 为0.5，加入1 mmol /L 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 于30 ℃诱导4 h。 将低温诱导的菌体以6 000 r /min 离心10 min，弃上清。沉淀用10 mmol /L 咪唑缓冲液重悬，漩涡振荡，超声波(5s × 10) 处理后10 000 r /min 离心10 min，上清经Ni⁺ -NTA 亲和层析柱纯化重组蛋白; 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE) 分析蛋白纯化效果。

无菌条件下取正常健康人新鲜外周血5 mL，加入1 mL 肝素钠抗凝后，加入等量Hanks 液混匀，加在等量淋巴细胞分离液上分离淋巴细胞。用细胞培养液重悬细胞，调整细胞数以1 × 10⁵ 个/孔加入96 孔板，2 种重组蛋白和SEC2 分别以不同浓度加入96 孔板中，每样3 个复孔。分别以牛血清白蛋白(BSA) 和植物血球凝集素(PHA-P) 作为阴性和阳性对照，CO₂ 培养箱中37 ℃培养72 h。取出96 孔板，每孔加入50 μL MTT 溶液，37 ℃继续培养4 h 后终止培养。3 000 r /min 离心10 min，弃去培养液，每孔加入120 μL 二甲基亚砜(DMSO) 溶解20 min。酶标仪测定570 nm 各孔吸光值。

无菌条件下取正常健康人新鲜外周血5 mL，加入1 mL 肝素钠抗凝后，加入等量Hanks 液混匀，加在等量淋巴细胞分离液上分离淋巴细胞。将淋巴细胞以2 × 10⁵ 个/孔加入96 孔板，大肠癌细胞以1 × 10⁴ 个/孔加入96 孔板中。2 种重组蛋白和SEC2 分别以不同浓度加入96 孔板中，每样3 个复孔。以含有10% 血清的细胞培养液作为空白对照孔，加入大肠癌细胞作为肿瘤对照孔，加与实验孔等量的淋巴细胞和目的蛋白作为本地释放孔，每孔3 个复孔，以牛血清白蛋白作为阴性对照。CO₂ 培养箱中37 ℃培养36 h，加入50 μL/孔的MTT 液，继续培养4 h。3 000 r /min 离心收集细胞，加入DMSO 溶解20 min，测定570 nm 各孔吸光度值。 抑瘤率(%) = 100-100 × (试验孔-本底释放孔) /(肿瘤对照孔-空白对照孔) 。

图 1

注: M1: DNA 1 kb marker; M2: DNA DL2000 marker; 1、2: 金葡菌SD、104 基因组提取物; 3、4: 保守引物PCR 扩增结果; 5、6: 重组表达载体双酶切验证; 7、8: 重组表达载体PCR 验证。 图 1 基因组提取与保守引物PCR、表达载体的双酶切及PCR 鉴定

金黄色葡萄球菌SD、104 株基因组DNA 分别扩增到2 个0.8 kb 的 DNA 片段(图 1a、b) 。测序分析结果显示，与GenBank 数据库中金黄色葡萄球菌N315 的SEP 基因的一致性分别达到 98.9%和99%。表明这2 株菌中含有2 种新型SEP 基因，在 GenBank 申请基因序列号分别为EF534984 和EF534985。阳性克隆经PCR 验证，单酶切、双酶切鉴定，双酶切小片段出现在690 bp 位置(图 1c、d) 。测序结果显示，成功构建原核表达质粒，分别命名为pET-28a-SEP_SD 和pET-28a-SEP₁₀₄。

图 2

注: M 蛋白质分子量标准(低) ; 1: IPTG 诱导SEPSD ; 2: 未加IPTG 诱导SEPSD ; 3: IPTG 诱导SEP104 ; 4: 未加IPTG 诱导SEP104 ; 5: IPTG 诱导pET28a 空质粒; 6: 纯化的SEPSD ; 7: 纯化的SEP104。 图 2 重组蛋白的诱导表达与纯化SDS-PAGE 电泳图

SDS-PAGE 分析结果显示，以未诱导的重组菌对照比较，经1 mmol /L IPTG 诱导4 h后的含重组质粒pET-28a-SEP_SD 和pET-28a-SEP₁₀₄ 的大肠埃希菌BL21(DE3) 菌株，在29 kDa 位置出现1 条新的蛋白条带，表明成功表达2 种重组蛋白，大小与预期一致。诱导过的重组菌经超声破碎、离心后，主要存在于上清中，表明蛋白以可溶形式表达。将上清液过Ni⁺ -NTA 亲和层析柱得到纯化的重组蛋白，纯度＞ 95%。

表 1

表 1 SEPs 刺激PBMC 增殖能力

表 1 SEPs 刺激PBMC 增殖能力

以BSA 为阴性对照，PHA-P 为阳性对照，重组蛋白SEP_SD 和SEP₁₀₄ 刺激PBMC 增殖的活性与SEC2 相近，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P ＜ 0.05) 。

图 3

图 3 SEPs 刺激PBMC 抑瘤实验

SEP_SD 和SEP₁₀₄ 在2 ～ 500 ng /mL 浓度范围内均有抑瘤效果，在200 ng /mL 时抑瘤效果最好，抑瘤率分别达到82% 和86%，特别是SEP₁₀₄ ，抑瘤率在任何浓度均高于SEC2。

SEs 作为一类超抗原分子，由于其能高效快速的激活T 细胞，引发细胞免疫和大量细胞因子的释放进而杀伤肿瘤细胞，因而在肿瘤治疗方面受到极大的关注^〔8〕。目前中国已经成功地开发出抗肿瘤金葡素注射制剂，其主要活性成分为 SEC2，提示超抗原在肿瘤治疗中具有巨大应用价值^〔9〕。本研究所克隆表达的SEP 表现出与SEC2 相似的刺激淋巴细胞增殖效应，并表现出高于SEC2 的刺激淋巴细胞分泌细胞因子从而抑制大肠癌细胞Cx-1 生长的作用。表明本研究所克隆表达的SEP 具有开发成为一种新型抗肿瘤生物制剂的可能，但仍需进一步研究来确定其毒副作用及临床上最佳治疗浓度等。由于肠毒素是引起细菌性食物中毒的主要致病因子之一，克隆获得的2 种新型基因对于提高肠毒素的检出率也有重要意义^{〔10, 11, 12〕}。

综上所述，本研究利用PCR 等分子生物学技术，克隆出新型的SEP 基因并在大肠埃希菌中表达重组蛋白，纯化后的 SEP 蛋白表现出了与SEC2 相似的促淋巴细胞增殖作用，并有高于SEC2 的抑制肿瘤细胞增殖的作用，为开发新型抗肿瘤生物制剂提供了依据。