中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (2): 191-193   PDF    
引用本文
曾立爱, 郭雄雄, 严汉英, 朱兰兰, 熊飞, 严红. 褪黑素对丙烯酰胺大鼠神经毒性拮抗作用[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(2): 191-193.
ZENG Li-ai, GUO Xiong-xiong, YAN Han-ying, et al. Interference effect of melatonin on acrylamide-induced neurotoxicity in rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(2): 191-193.
褪黑素对丙烯酰胺大鼠神经毒性拮抗作用
曾立爱1, 郭雄雄1, 严汉英2, 朱兰兰1, 熊飞1, 严红1     
1. 华中科技大学同济医学院公共卫生学院卫生毒理系教育部环境与健康重点实验室, 湖北武汉430030;
2. 武钢安全环保部安全环保研究所
收稿日期: 2011-02-21.
基金项目: 国家自然科学基金(30771822)
作者简介: 曾立爱(1982- ),女,江西南丰人,讲师,硕士,研究方向:神经毒理学。
通讯作者: 严红,E-mail:yanhong@mails.tjmu.edu.cn
摘要: 目的 探讨褪黑素(MT)同时干预对丙烯酰胺(ACR)神经毒性作用的影响。方法 40只SD雄性大鼠按体重随机分为4组,每组10只,分别为对照组、丙烯酰胺、褪黑素与褪黑素干预组,丙烯酰胺2.3 mmol/L溶液日常饮用;褪黑素腹腔注射2.5 mg/kg,1次/d,连续9周。每周进行步态评分,试验结束后取出大脑、小脑检测抗氧化指标。结果 与对照组比较,丙烯酰胺组与褪黑素干预组第3周开始步态分值明显升高,丙烯酰胺组大脑皮层SOD活性降低9.89%,小脑SOD活性、GSH含量分别降低7.49%1、2.31%,差异均有统计学意义(P<0.05);与丙烯酰胺组比较,褪黑素干预组第4、5周步态分值分别下降22.92%、15.85%,大脑皮层SOD活性升高14.96%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 丙烯酰胺能导致大鼠步态改变,脑组织SOD活性及GSH含量降低。褪黑素对丙烯酰胺毒性早期有一定缓解作用,后期不明显。
关键词: 丙烯酰胺     褪黑素     神经毒性     步态评分     病理损伤     氧化损伤    
Interference effect of melatonin on acrylamide-induced neurotoxicity in rats
ZENG Li-ai , GUO Xiong-xiong , YAN Han-ying, et al    
Department of Health Toxicology, Key Lab of Environment and Health of Ministry of Education, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Abstract: Objective To explore the interference effect of melatonin on acrylamide-induced neurotoxicity in rats. Methods Forty adult male SD rats were randomly divided into control group,acrylamide group,melatonin group,and melatonin intervention group(10 in each group).Acrylamide group was treated with 2.3 mmol/L of acrylamide in daily drinking.Rats in melatonin group were administered 2.5 mg/kg of melatonin by intraperitoneal injection once a day.All the treatments continued 9 weeks.Gait scores were analyzed once a week.The histopathologial injuries of cerebrum and cerebellum were observsed by hematoxhlin-eosin(HE)stain.The contents of of malondialdehyde(MDA),glutathione(GSH), superoxide dismutase(SOD),and glutathione peroxidase(GSH-Px)in cerebral cortex and cerebellum tissue were determined. Results Compared with the control group,the gait scores rised markedly from the third week to the end of experiment(P<0.05)in acrylamide group and melatonin intervention group.In acrylamide group,the SOD activity in cerebral cortex decreased by 9.89% (P<0.05)and the SOD activity and GSH content in cerebellum decreased by 7.49% and 12.31%,respectively(P<0.05).Compared with acrylamide group,gait scores decreased at forth and fifth week by 22.92% and 15.85%,respectively(P<0.05),and the SOD activity in cerebral cortex increased by 14.96% in melatonin intervention group(P<0.01). Conclusion Acrylamide could induce gait abnormality,inhibit the activity of SOD and the content of GSH,while melatonin could alleviate the neurotoxicity induced by acrylamide at the early stage but have no protective effect later in rats.
Key words: acrylamide     melatonin     neurotoxicity     gait score     pathologic injury     oxidative damage    

丙烯酰胺(acrylamide，ACR) 广泛应用于合成聚丙烯酰胺等上百种产品。丙烯酰胺是一种神经毒物，目前，其导致神经毒性的作用机制仍未阐明。有学者认为，氧化应激可能是丙烯酰胺导致神经毒性的机制之一，且一些抗氧化剂如维生素 C 和维生素E 可以减轻丙烯酰胺引起的毒性作用〔1, 2〕。褪黑素(melatonin，MT) 是松果体腺分泌的一种激素，早在20 世纪90 年代，Tan 等〔3〕报道褪黑素具有抗氧化活性，能有效清除氧自由基，减少外来化合物的神经毒性，保护大分子物质免受氧化性损伤〔4〕。本研究采用大鼠长期饮用低剂量含ACR 水染毒方式，探讨褪黑素对丙烯酰胺神经毒性作用，结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 试验动物

健康成年雄性SD 大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心) 40 只，体重(220 ± 20) g，许可证号: SCXK(鄂) 2004-0007 号。大鼠在12 h∶ 12 h 明暗循环的动物房内适应性饲养1 周。

1.2 主要试剂与仪器

丙烯酰胺(纯度99.9 %) 、褪黑素 (美国Sigma 公司) ; 丙二醛(malondialdehyde，MDA) 、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH) 、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px) 活力测定试剂盒(南京建成生物研究所) 。其余试剂均为市售分析纯。Leica Jung CM 1800 恒冷切片机、leika DM LB2 显微镜(德国Leica 公司) ; HPIAS-1000 高清晰彩色病理图文分析系统(武汉清平影像技术有限公司) ; Spectramx M2 多模式全能酶标仪(美国Molecular Devices /MD 公司) 。

1.3 方法 1.3.1 动物分组及染毒

将大鼠按体重随机分为4 组，即对照、丙烯酰胺、褪黑素、褪黑素干预组，每组10 只，均单笼饲养。采用自由饮水染毒方式，对照组饮用灭菌蒸馏水，丙烯酰胺与褪黑素干预组饮用2.3 mmol /L 丙烯酰胺溶液，褪黑素与褪黑素干预组腹腔注射2.5 ㎎ /㎏褪黑素，1 次/d，注射容量为1 mL/kg，连续9 周。分别于染毒前后每周对各组大鼠进行步态评分。在末次给药24 h 后，各组大鼠断头处死，在冰盘上取出大脑、小脑备用。

1.3.2 神经行为学评价〔5〕

将大鼠放在空旷地面使其自主行动，每只大鼠观察3 min。记录分值为1 ～ 4 分，步态改变越明显，分值越高，1 分: 正常步态; 2 分: 轻微异常步态(大鼠后肢稍微张开、轻度无力) ; 3 分: 中度异常步态(大鼠后肢张开、 中度无力、移动时后肢外展、行动吃力) ; 4 分: 重度异常步态 (大鼠后肢明显张开、不能支持体重、无法站立、足上翻) 。

1.3.3 大鼠脑组织病理分析

大脑、小脑组织用10 % 甲醛固定，按常规石蜡包埋、沿背侧作冠状连续切片，片厚6 μm，苏木素-伊红染色(HE) ，光学显微镜观察大鼠大脑、小脑组织病理改变。

1.3.4 大鼠脑组织氧化应激指标测定

大脑皮层、小脑组织用生理盐水制成10 % 匀浆液后，离心吸取上清液移置多个 Eppendorf 管中分装。测定MDA 及GSH 含量、SOD 及GSH-Px 活性，测定方法按试剂盒说明书进行。蛋白质定量采用考马斯亮兰法。

1.4 统计分析

实验数据采用x±s 表示，采用SPSS 12.0 统计软件进行分析，检验标准α = 0.05，步态评分采用Mann-Whitney U 检验，其他数据进行方差分析，两两比较用最小显著差法。

2 结 果 2.1 大鼠神经行为改变(表 1)
表 1 不同染毒时间各组大鼠步态评分(分，x±s，n = 10)

丙烯酰胺组与褪黑素干预组大鼠第3 周开始出现异常步态，步态分值明显高于对照组 (U = 18、24，P ＜ 0.05) 。与丙烯酰胺组比较，褪黑素干预组大鼠步态改变较轻微，第4、5 周时步态分值明显降低，分别下降 22.92%、15.85%。

2.2 大鼠大脑组织病理改变

对照组及褪黑素组大鼠大脑各细胞层次清楚，神经元细胞核大，核仁明显，胶质细胞体积小，着色深，染色质呈均匀蓝色。丙烯酰胺组出现血管扩张充血，炎症细胞浸润，未出现细胞形态学的改变，提示丙烯酰胺作用下大脑产生了炎性反应，具有一定的损伤作用。与丙烯酰胺组比较，褪黑素干预组症状明显改善，恢复至对照组水平，表明褪黑素能够改善血管扩张，并具有明显的抗炎作用。

2.3 大鼠小脑组织病理改变(图 1)
图 1 褪黑素干预下丙烯酰胺对大鼠小脑组织病理改变(HE 染色，× 400)

光镜下可见对照组大鼠小脑从外向内具有明显的3 层结构，分子层、蒲肯野细胞层及颗粒细胞层，分子层神经细胞体积小，呈分散分布，蒲肯野细胞层呈单层排列，颗粒细胞层细胞分布密集，由颗粒细胞和高尔基细胞组成。其余3 组无明显异常，提示丙烯酰胺对小脑无明显损伤。

2.4 大脑皮层MDA 含量和抗氧化酶活性改变(表 2)
表 2 大脑皮层MDA 含量和抗氧化酶活性改变(x±s，n = 10)
与对照组比较，丙烯酰胺组SOD 活性降低9.89%，褪黑素组SOD 活性升高8.67%，差异有统计学意义(F = 6.628，P ＜ 0.05) ，MDA、GSH 含量及GSH-PX 活性变化不明显。与丙烯酰胺组比较，褪黑素干预组SOD 活性升高14.96% (F = 6.628，P ＜ 0.01) 。 2.5 小脑MDA 含量和抗氧化酶活性改变 与对照组SOD 活性 ［(72.33 ±7.98) U/mgprot］、GSH 含量［(5.20 ±0.56) mg/gprot］比较，丙烯酰胺组SOD 活性［(66.91 ± 5.62) U/mgprot］、GSH 含量 ［(4.56 ±0.77) mg/gprot］分别降低7.49%、12.31%，差异有统计学意义(F = 1.906、2.272，P ＜ 0.05) ，GSH-PX 活性及MDA 含量变化不明显，褪黑素组及褪黑素干预组各指标无明显差异。 与丙烯酰胺组比较，褪黑素干预组SOD 活性及GSH 含量有所升高，但差异无统计学意义(P ＞ 0.05) ，MDA 含量及GSH-PX 活性均无明显改变。 3 讨 论 本实验结果显示丙烯酰胺组大鼠出现行动吃力、移动时后肢外展、足张开，提示大鼠神经行为受到严重损伤，这与李闪霞〔6〕等发现丙烯酰胺可引起大鼠运动神经损伤相一致。 病理结果显示丙烯酰胺组大鼠大脑血管扩张充血，炎症细胞浸润，但未出现细胞形态学的改变，小脑未出现明显异常。表明本实验动物模型中丙烯酰胺虽然导致明显的神经功能性损伤，但未导致明显的神经结构性损伤。本研究结果还显示丙烯酰胺可抑制大脑皮层、小脑SOD 活性并降低小脑GSH 含量，但反应脂质氧化损伤的脂质过氧化产物MDA 无明显升高，提示脂质过氧化可能不是本模型中丙烯酰胺中毒的主要机制。 同时给予2.5 mg /kg 褪黑素干预后，大鼠在第4、5 周时步态分值明显降低，表明在丙烯酰胺中毒早期，褪黑素能减轻步态的异常改变，但随着时间延长及中毒程度加重，褪黑素对步态的改变无缓解作用。褪黑素干预组大鼠大脑未出现明显异常，提示褪黑素能够改善大脑血管扩张，并具有明显的抗炎作用。试验中还发现褪黑素干预组大鼠大脑皮层SOD 活性、 小脑SOD 活性及GSH 含量均明显高于丙烯酰胺组，恢复至对照组水平，表明褪黑素在一定程度上能够增强大脑皮层、小脑中抗氧化能力。
参考文献
〔1〕 沈玉芹,吕立夏,杨翠香.VitC对丙烯酰胺诱导小脑损伤的保护作用[J].同济大学学报,2004,25(5):372-373.
〔2〕 刘仁平,童建,洪承皎.硒和维生素E对丙烯酰胺致V79细胞毒性的拮抗作用[J].职业与健康,2006,22(24):2161-2164.
〔3〕 Tan DX,Chen LD,Poeggeler B,et al.Melatonin:a potent,endogenous hydroxyl radical scavenger[J].Endocrinol,1993,1:57-60.
〔4〕 Pieri C,Marra M,Moroni F,et al.Melatonin:a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin[J].E.Life Sci,1994,55:271-276.
〔5〕 LoPaehin RM,Ross JF,Reid ML,et al.Neurological evaluation of toxic axonopathies in rats:acrylamide and 2,5-hexanedione[J].Neurotoxicology,2002,23:95-110.
〔6〕 李闪霞,崔宁,张翠丽,等.大鼠亚慢性丙烯酰胺中毒神经行为功能的改变[J].中国公共卫生,2004,20(12):1458-1459.