膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤。流行病学资料表明，摄入十字花科蔬菜能明显降低膀胱癌的发病风险^〔1〕。莱菔硫烷(sulforaphane，SFN) 为异硫氰酸盐(isothiocyanates，ITCs) 衍生物，广泛存在于十字花科植物中，在西兰花中含量最多，是蔬菜中防癌抗癌效果较好的天然活性物质之一^〔2〕。 循环浓集实验及人群志愿者实验表明，机体尿液对摄入体内的莱菔硫烷有强大的蓄积能力，提示莱菔硫烷对膀胱上皮的癌症有明显的拮抗作用。目前，国内外关于莱菔硫烷与膀胱癌之间的研究资料较少。近年研究发现，环氧化酶(cyclooxygenase-2，COX-2) 的过表达与移行型膀胱癌的发展、预后以及复发都密切相关^〔3〕。研究认为，ITCs 作用于细胞发挥作用，与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK) 和磷脂酰肌醇(-3) 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) 信号途径有关^〔4〕。本研究探讨MAPKs 和PI3K 信号途径在SFN 抑制膀胱癌增殖、COX-2 表达中的作用，为食源性癌症化学预防剂的开发应用提供理论依据。

人膀胱移行上皮癌细胞T24，取自Ⅲ级膀胱癌移行细胞癌组织，购自中科院上海生命科学研究院细胞库。

莱菔硫烷(美国LKT 有限公司) 。TRIzol Total RNA Isolation 试剂盒(美国Gibco BRL 公司) 、RNA 提取试剂 (TRIZOL，美国Invitrogen 公司) ; 其他试剂(美国ABI 公司) ; 逆转录试剂盒Primescript TM RT Reagent Kit(大连宝生物公司) ; Real-time PCR 所用探针、引物由美国Sigma 公司合成。c-Jun 氨基端激酶(c-jun NH2-terminal kinase，JNK) 特异抑制剂(SP600125) 、MAPK 激酶/胞外信号调节激酶(MAPK kinase /extracellular signal-regulated kinase，MEK/ERK) 抑制剂 (PD98059) 、p38 抑制剂(SB202190) 和PI3K 抑制剂 (LY294002) (英国TOCRIS 公司) 。

人膀胱癌T24 细胞在含有10% 小牛血清、 100 U/mL 青霉素、100 μg /mL 链霉素和2 mmol /L L-谷氨酰胺的RPMI 1640 培养基中，于37 ℃、5%CO2 培养箱中常规培养。细胞每2 d 换1 次培养液，3 ～ 4 d 传1 代。

取处于对数生长期的T24 细胞常规消化，用10%RPMI 1640 完全培养液配制成7 × 104 个/mL 细胞悬液。每孔接种100 μL 细胞悬液，每个浓度设4 个平行样。在37 ℃、5%CO2 培养箱中培养过夜。吸出培养液，每孔加入含有0、5、10、20 μmol /L 的SFN RPMI1640 培养液200 μL，在37 ℃、5%CO2 培养箱培养1 ～ 7 d。从给处理开始每天取1 块96 孔按前述方法测定其吸光度值。在第3 d 结束时，更换含有相同浓度的SFN 的完全培养液直至实验结束。

总RNA 提取采用GenEluteTM Mammalian RNA kit(美国Sigma 公司) 进行测定，按说明书进行操作。RNA 浓度和纯度测定采用NanoDrop 进行测定。RNA 比值＞ 1.9 方可用于下一步实验。

主要步骤如下: (1) 样品稀释: 用 PCR 水将样品先做1∶ 10 和1∶ 100 两个倍数稀释。然后依次再用PCR 水做系列稀释; (2) 在PCR 室中上样(96 孔板) ，每孔10 μL。(3) 配置反应混合体系(reactions，rxns) 和PCR 扩增。(4) 计算PCR 效率。

采用Primescript TMRT Reagent Kit 进行。 总RNA 提取采用GenEluteTM Mammalian RNA kit(美国Sigma 公司) 进行测定，按说明书进行操作。反转录和PCR 按照日本TaKaRa 公司试剂盒操作。COX-2 正向引物: 5'-GAA TCA TTC ACC AGG CAA ATT G-3'，反向引物下: 5'-TCT GTA CTG CGG GTG GAA CA-3'，探针: 5'-TCC TAC CAC CAG CAA CCC TGC CA complement-3'。试验结果通过2^-ΔΔCt 方法计算诱导倍数。公式如下: ΔΔCt = (C_{tt， arget-C t，185s}) _Timex-(C_t，target-C_t，185) _Time0 ; Flod = 2^-ΔΔCt。

应用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析，多组之间的比较采用ANOVA 方差分析，多组与对照组之间的比较采用Dunnett(q') 检验，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

图 1

图 1 莱菔硫烷对膀胱癌细胞增殖影响

对照组细胞在第1d 开始生长速度就快于其他处理组细胞，在第3d 进入指数生长期。而SFN 处理的各组细胞则生长缓慢，在整个实验期间内未进入指数生长期。20μmol /L SFN 几乎完全抑制细胞增殖，并且在第5d 后细胞数已低于接种时数量。

表 1

表 1 莱菔硫烷对COX-2 mRNA 表达影响

表 1 莱菔硫烷对COX-2 mRNA 表达影响

用5 ～ 10 μmol /L SFN 处理T24 细胞10 h 和24 h 后。结果表明，SFN 能以剂量依赖方式明显抑制COX-2 mRNA 的表达，SFN 作用 T24 细胞10 h 后对COX-2 mRNA 的抑制作用更明显。

表 2

表 2 MAPKs 和PI3K 抑制剂在SFN 抑制细胞增殖中的作用

表 2 MAPKs 和PI3K 抑制剂在SFN 抑制细胞增殖中的作用

本研究分别选用了3 条MAPKs 信号激酶抑制剂分别为: JNK 特异抑制剂(SP600125) 、MEK/ERK 抑制剂 (PD98059) 、p38 抑制剂(SB202190) 和PI3K 抑制剂 (LY294002) 。结果表明，4 种抑制剂均能在不同程度上影响 SFN 抑制T24 细胞增殖的作用。根据表 2 结果计算得到的半数抑制浓度(IC₅₀) ，SFN 为(16.1 ± 0.62) 、，当用MAPKs 的3 个特异性抑制剂以及PI3K 抑制剂后，IC₅₀ 值均有一定得升高，其中，LY294002 和SB202190 抑制剂阻断后，能明显升高 SFN 的半数抑制浓度［(分别升高为(28.7 ± 2.45) 和(29.8 ± 1.84) ，与SFN 组比较，P ＜ 0.01) ］，说明p38 抑制剂和PI3K 抑制剂在SFN 抑制T24 细胞增殖中发挥重要作用。

表 3

表 3 p38MAPK 和PI3K 抑制剂在莱菔硫烷抑制 COX-2 表达中作用

表 3 p38MAPK 和PI3K 抑制剂在莱菔硫烷抑制 COX-2 表达中作用

分别用10 μmol /L LY294002 和10 μmol /L SB202190 处理T24 细胞1h 后，再换成含有0 ～ 20 μmol /L SFN 的培养液继续培养24 h。结果表明，LY294002 和 SB202190 对COX-2 mRNA 的作用不同。LY294002 不能阻断 SFN 对COX-2 mRNA 的抑制作用，而SB202190 则明显阻断了 SFN 对COX-2 mRNA 的抑制作用，甚至是完全逆转了SFN 对 COX-2 mRNA 的抑制作用。提示p38MAPK 激酶信号途径在 SFN 抑制COX-2 mRNA 表达的过程中起主要作用。

莱菔硫烷是已经被证实具有防癌抗癌活性的异硫氰酸盐衍生物之一。本研究发现，3 条MAPKs 信号途径特异的激酶抑制剂和PI3K 激酶抑制剂在不同程度上影响SFN 抑制T24 细胞增殖的作用，而且p38MAPK 通路在SFN 抑制COX-2mRNA 表达过程中起重要作用。

MAPK 信号途径和PI3K 信号途径是调控细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的经典途径^〔4〕。目前认为，p38 激酶通路在炎症反应、细胞生长、细胞分化和细胞死亡诸多过程中起关键作用^{〔5, 6〕}。与p38 在炎症反应中的特殊作用相同，COX-2 也在其中扮演重要角色。当细胞受到脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) 、炎性因子、生长因子和致癌剂的刺激后，COX-2 才被诱导。COX-2 是花生四烯酸合成前列腺素(prostaglandin，PG) 的限速酶，在抑制免疫功能、抑制细胞凋亡、引起细胞过度增生甚至增加癌细胞的侵袭性等方面发挥关键作用^〔7〕。因此，COX-2 已成为癌症治疗和预防的关键靶点^{〔7, 8〕}。

本研究结果表明，PI3K 信号途径和p38MAPK 信号途径在SFN 抑制T24 细胞增殖中起关键作用，而p38MAPK 信号途径还在SFN 抑制COX-2 mRNA 的表达中发挥关键作用。 提示p38MAPK 是SFN 发挥抗癌作用中的重要靶点之一，该研究结果为深入探讨SFN 的抗癌作用机制提供了新的思路。