原发性高血压(essential hypertension，EH) 是由于遗传和环境因素共同作用而引起的一种常见的严重影响人类生命健康的慢性复杂性疾病。一氧化氮(NO) 是心血管系统内皮功能舒张的一种重要调节因子^〔1〕，研究认为，内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 异常可影响血浆中NO 水平，从而导致慢性高血压病的发生^〔2〕。其中eNOS 基因27 bp 数目可变串联重复序列(27 bp VNTR) 多态性与 EH 发病的相关性，在不同地区或不同民族中有所差异^{〔3, 4, 5, 6〕}。 为了解新疆哈萨克族原发性高血压与eNOS 基因27 bpVNTR 多态性关系，本研究选取新疆塔城地区的哈萨克族居民与同居地汉族居民，进行eNOS 基因27 bpVNTR 多态性的观察和比较分析，现将结果报告如下。

采用分层整群抽样方法，选取新疆天山北麓塔城地区沙湾县博尔通古乡牧区的下西湾村、加尔苏瓦提村、阔克黑牙村、齐勒窝则可村、喀拉巴斯陶村的≥18 岁哈萨克族及汉族居民进行原发性高血压现况调查，随机抽取哈萨克族和汉族原发性高血压患者分别为363 例、346 例，按照年龄、性别均衡的原则选取非高血压患者哈萨克族和汉族居民分别为 370 人、385 人作为对照。排除继发性高血压、心肌病、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、肝肾功能不全，以及孕妇、哺乳期及口服避孕药女性。各组调查对象均经知情同意。

采用自行编制的调查表进行基本情况问卷调查，同时按标准方法测量血压、身高、体重、腰围、 臀围，计算体质指数和腰臀比; 采集空腹血液标本10 mL，肝素和乙二胺四乙酸盐抗凝，现场分离血浆和血液，血浆当日进行生化检测，其余血样用于提取基因组DNA。由受过培训的乡卫生院医护人员、研究生、医学本科3 ～ 4 年级的哈萨克族和汉族大学生以面对面的方式进行调查、体检和采血。原发性高血压诊断采用1999 年WHO/ISH 关于高血压病的诊断标准^〔7〕: 收缩压≥140 mmHg(1 mmHg = 0.133 kPa) 和(或) 舒张压≥90 mmHg。

(1) 主要仪器: Olympus AU2700 全自动生化仪(日本Olympus 公司) TD5A-WS 台式低速离心机、H1650-W台式微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司) ; 凝胶成像仪(上海培清科技有限公司) ; FR-250 电泳仪(上海复日科技有限公司) ; 2720 Thermal Cycler、 3130xl Genetic Analyzer(美国ABI 公司) 。(2) 试剂: 十二烷基硫酸钠(美国Sigma 公司) 、蛋白酶K(德国Merck 公司) ; 引物、苯酚、氯仿、异戊醇(上海生工生物工程技术服务有限公司) ; PCR 反应缓冲液、Hotstar Taq 聚合酶(德国QIAGEN 公司) ; MgCl2、dNTP 试剂(英国GENERAY BIOTECH 公司) ; ELISA 试剂盒(美国ADL 公司) ; Hi-Di 试剂(美国ABI 公司) 。

采用Olympus AU2700 全自动生化仪检测空腹血糖、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、肌酐、尿酸，载脂蛋白等。

采用多重单碱基延伸分型技术(multiplex snapshot) 进行eNOS 基因27bpVNTR 多态性分析。(1) 基因组DNA 提取: 取抗凝后血液样品，采用酚-氯仿法进行DNA 抽提，首先将抽提的DNA 和标准分子量marker 进行电泳，使用Quantity One 软件标化marker 电泳条带，然后对比每个DNA 样本的条带亮度，DNA 浓度标化至25 ng / μL。(2) 引物: 利用在线Primer 3.0 软件(http: / /frodo． wi． mit． edu /cgi-bin /primer3 _www． cgi) 设计引物，其中上游引物: 5'-TATGGTAGTGCCTTGGCTGGA-3'; 下游引物: 5'-TGCTCCTGCTACTGACAGCAC-3'; 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。(3) PCR 反应体系: PCR 反应体系 20 mL，其中基因组DNA 25 ng; 10 × buffer 2 μL，25 mmol /L MgCl2 0.4 mL; dNTP 0.4 μL; 2 μmol /L 的PCR 引物2 mL; Hotstar Taq 聚合酶0.2 μL。反应程序为预变性94 ℃ 5 min 后，进行35 个循环，每个循环94 ℃变性30 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃持续10 min 延伸。

取PCR 扩增产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪成像，鉴定PCR 产物。应用Multiplex SNaPshot 技术进行基因分型，荧光PCR 产物采用ABI3130XL 测序仪，取0.5 μL 纯化后延伸产物，与0.5 μL 的Liz500 SIZE STANDARD、9 μL 的Hi-Di 混匀，95 ℃ 变性5 min，采用 ABI3130XL 测序仪进行检测，采用GeneMapper 4.0(Applied-Biosystems Co.Ltd． USA) 分析收集的原始数据。

采用双抗体夹心法(ELISA 试剂盒) 测定血浆eNOS 水平。采用精密微孔板96 孔，将已知eNOS 浓度标准品、未知浓度样品加入微孔酶标板内进行检测。先将eNOS 和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B 和酶结合物同时作用，产生颜色，颜色的深浅和样品中eNOS 的浓度呈比例关系。定量酶标仪检测波长为450 nm，读取各孔并记录吸光度(A) 值，定量试验敏感度为0.01 ng /mL。 1.3 统计分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，以哈迪-温伯格定律(Hardy-Weinberg Law) 平衡检验确认群体代表性(等位基因预期数计算公式: E_{(等位基因预期数)} = N_(观测数) × P_等位基因² ，P 为各等位基因在相应组出现的频率) 。结果比较采用χ² 检验、t 检验、单因素方差分析等。不符合正态分布数据采用对数转换后进行分析，数值用x±s 表示，等位基因直接计数。

表 1

表 1 新疆哈萨克族和汉族高血压组与对照组基本情况比较(x±s)

表 1 新疆哈萨克族和汉族高血压组与对照组基本情况比较(x±s)

2 个民族居民中，原发性高血压组的收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压、体质指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、肌酐、尿酸、载脂蛋白A1 /B 平均水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P ＜ 0.05) ，高密度脂蛋白、 载脂蛋白-A1、载脂蛋白-B 的差异无统计学意义(P ＞ 0.05) 。而年龄、空腹血糖、甘油三酯在哈萨克族人群中2 组间差异有统计学意义(P ＜ 0.05) 。

Hardy-Weinberg 平衡检验结果可见，2 个民族高血压组、对照组、合计人数的eNOS 基因27bpVNTR 的基因型分布频率均无统计学意义(P ＞ 0.05) ，符合遗传平衡定律，提示该人群有较好代表性。

表 2

表 2 27 bpVNTR 基因型及等位基因分布及患病风险估计

表 2 27 bpVNTR 基因型及等位基因分布及患病风险估计

结果可见，哈萨克族和汉族EH 组与对照组的27 bp VNTR 基因型及等位基因携带率组间组内差异均无统计学意义(均P ＞ 0.05) 。汉族EH 组未检测到bc 基因型，但差异无统计学意义(P ＞ 0.05) 。2 个民族EH 组与对照组中不同基因型携带者患原发性高血压的风险差异均无统计学意义，提示27 bp VNTR 基因型多态性可能不是原发性高血压的危险因素。

表 3

表 3 2 个民族基因型及等位基因与血浆eNOS 水平比较(x±s，ng /mL)

表 3 2 个民族基因型及等位基因与血浆eNOS 水平比较(x±s，ng /mL)

结果可见，2 个民族的EH 组与对照组eNOS 基因27bpVNTR 基因型及等位基因与血浆eNOS 水平比较，组间差异无统计学意义(P ＞ 0.05) ; 单因素方差分析显示，组内各基因型血浆 eNOS 水平差异亦无统计学意义(P ＞ 0.05) 。2 个民族间比较，汉族人携带bb、aa、ab 基因型的血浆eNOS 平均值高于哈萨克族，差异有统计学意义(均P ＜ 0.05) 。

新疆哈萨克族是中国高血压高发民族之一，研究表明，哈萨克族青少年的血压高于同龄的其他民族^〔8〕，而且成人高血压的患病率明显高于同一居住地的汉族人群^{〔9, 10, 11〕}，提示哈萨克族高血压病多发，既与遗传因素有关，同时也与其高盐、高脂饮食，缺少蔬菜摄入密不可分。本研究结果显示，2 个民族病例组的收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压、体质指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、肌酐、尿酸、载脂蛋白A1 /B 的平均水平均高于对照组，这些指标作为原发性高血压的影响因素，在2 个民族中均存在，与邓峰美等^{〔12, 13〕}报道一致。

本研究检测到第4 内含子27 bp VNTR 有重复6 次者，记为c 等位基因，其中汉族对照组中携带c 等位基因1 人，哈萨克族对照组中1 人，哈萨克族高血压组2 人，未见到在其他不同地区或不同民族的同类报道。哈萨克族人群中bb、aa、ab、 bc 等4 种基因型和等位基因b、a、c 在EH 组及对照组中的分布频率差异无统计学意义(P ＞ 0.05) 。汉族EH 组未检测到 bc 基因型，EH 组及对照组基因型和等位基因的分布频率差异无统计学意义(P ＞ 0.05) 。

有文献报道，携带eNOS 基因27 bpVNTR a 等位基因与舒张压升高和平均动脉压有关^〔14〕; Jemaa^〔15〕研究显示，eNOS 基因4a4b 与突尼斯人高血压直接相关。国内路萍等^〔16〕研究北京地区EH 患者，结果显示，eNOS 基因27 bp VNTR 重复a 等位基因的人具有患原发性高血压的一定危险性。但研究报道不完全一致，Yokoyama 等^〔17〕报道，在日本京都人群中，未发现eNOS 的等位基因与血压相关，与新疆地区对哈萨克族人群研究结果一致^{〔18, 19〕}，也与本研究对哈萨克族与汉族人群的研究结果相一致。

本研究结果还显示，汉族人群携带bb、aa、ab 基因型的血浆eNOS 平均值高于哈萨克族，差异有统计学意义(P ＜ 0.05) 。 提示血浆eNOS 水平可能是同居地汉族居民比哈萨克族居民高血压患病率低的一个重要调节因子，但哈萨克族EH 组与对照组的血浆eNOS 水平差异无统计学意义，各基因型组间差异也无统计学意义，提示可能有一定的遗传因素影响。 综上所述，不论民族或地域不同，超重、肥胖及血脂代谢紊乱均与EH 有密切的关系，新疆哈萨克族和汉族eNOS 基因 27bpVNTR 多态性与EH 无关，汉族人携带bb、aa、ab 基因型的血浆eNOS 平均值高于哈萨克族人。