2008年6月，海南省海口市秀英区长流镇某村发生因聚餐引起的霍乱暴发疫情，为了解霍乱疫情分离株的流行菌型及其耐药性，为霍乱疫情的快速有效控制和临床治疗提供科学依据，本研究收集了腹泻患者、密切接触者及外环境标本，对分离的6株霍乱弧菌进行了血清学分型、噬菌体－生物分型、霍乱毒素基因检测、脉冲场凝胶电泳分子分型和药物敏感性试验，现将结果报告如下。

2008年6月10日，海口市美李村李某家58人聚餐后，当天出现腹泻等症状者26人，分别采集腹泻患者，密切接触者肛拭子标本41份，采集李某家厨房、厕所等外环境标本4份，共检出霍乱弧菌6株，分别为患者肛拭子3株; 密切接触者肛拭子2株(均是同餐健康者，其中1株是李某家人，患者接触者) ; 该接触者家用厕所涂抹拭子1株。

O1群霍乱弧菌多价血清，稻叶型、小川型及O139群霍乱弧菌诊断血清(中国药品生物制品检定所) ; 微量生化管、碱性胨水(广东环凯微生物科技有限公司) ; 4号琼脂(上海疾控华康科技公司) ; 营养肉汤、营养琼脂(北京陆桥技术有限责任公司) ; pH8.0山梨醇发酵培基，按文献〔1〕自行配制; 17种抗生素纸片和水解酪蛋白(M-H) 琼脂(英国OXOID 公司) ; 聚合酶链反应(PCR) 方法反应体系成分: TaqDNA 聚合酶(5U/μL) 、DL2000 Marker (大连 TaKaRa 宝生物公司) ; 核酸染料(北京赛百盛公司) 。

第Ⅳ组霍乱噬菌体、埃尔托型霍乱弧菌VP1 ～ VP5分型噬菌体和溶原噬菌体(919) (广东省疾病预防控制中心实验室) ，溶原性检测指示菌16141SM6 (本实验室保存) 。

采用4号琼脂平板进行菌株分离培养，挑取可疑菌落进行O1群多价和O139群霍乱弧菌诊断血清凝集实验，多价凝集再用稻叶型、小川型血清进行血清学分型^〔1〕。分纯菌株进行粘丝试验、氧化酶试验、动力试验、微量管生化试验、噬菌体－ 生物分型，参照第5版《霍乱防治手册》^〔1〕操作。

采用聚合酶链反应(PCR) 方法。(1) 引物序列: ctxA P1: 5'-CTC AGA CGG GAT TTG TTA GGC ACG-3'; ctxA P2: 5'-TCT ATC TCT GTA GCC CCT ATT ACG-3'; 扩增产物大小为308 bp。(2) 核酸提取: 取纯菌至装200 μL 无菌水的1.5ml 离心管中，盖紧于振荡器上混匀，煮沸10 min 后，立即转移至冰水中，5 min 后，12 000 r /min 离心5 min，取上清－ 20℃ 保存或直接用作PCR 模板。(3) PCR 反应体系: 总体积20 μL，包括10 × Buffer 2μL，2.5 mmol /L dNTP 2μL，10μmol /L 引物P1和P2各0.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，灭菌蒸馏水12.5 μL，DNA 摸板2μL。 (4) 反应条件: 95℃ 预变性2 min; 94℃ 变性30s，53℃ 退火30s，72℃延伸40s，31个循环; 72℃延伸3 min。(5) 扩增产物电泳检测: 用0.5 × Tris-硼酸(TBE) 电泳缓冲液配制1.5% 琼脂糖凝胶，加热溶解加入GoldViewTM 核酸染料 (5 μL/100 mL) 。取6 μL PCR 产物与1 μL 溴酚兰溶液混匀，上样，以DL2000 Marker 作参照，于120V 恒流电泳30 min，凝胶成像仪进行观察拍照。

所用试剂、设备和实验均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供和完成。

参照文献〔2〕，采用WHO 推荐的改良K-B 纸片法进行17种抗生素的敏感性试验。链霉素、环丙沙星、氨苄西林、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿米卡星、复方新诺明、妥布霉素、磺胺异恶唑、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢噻吩、卡那霉素的抑菌圈结果判定按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI) 文件^〔3〕规定，强力霉素、多粘菌素B 和诺氟沙星的抑菌圈结果判定按照文献〔1〕规定进行，使用大肠埃希菌 ATCC25922进行质控。

41份标本中，共分离到霍乱弧菌6株，菌株编号为HI2008027 ～ HI2008032。6株菌O139群血清和盐水均阴性，O1群多价均凝集，其中5株稻叶型血清凝集，1株小川型血清凝集，血清学分型显示，5株为O1群稻叶型霍乱弧菌，1株为O1群小川型霍乱弧菌。氧化酶试验、 粘丝试验、动力试验均呈阳性反应，微量生化管试验结果: 葡萄糖产气、葡萄糖磷酸盐胨水VP、阿拉伯糖、肌醇、精氨酸双水解酶均阴性，蛋白胨水、蔗糖、甘露糖、赖氨酸脱羧酶均阳性，符合霍乱弧菌生化反应特征。

6株菌均被第Ⅳ组霍乱弧菌噬菌体原液(109 PFU/mL) 裂解，不被常规(106 PFU/mL) 裂解，均属埃尔托生物型霍乱弧菌。6株菌均可裂解VP1-VP5噬菌体，为1型噬菌体型; 6株菌溶原性测定和山梨醇发酵试验均阴性，对溶原噬菌体的敏感性和溶血试验均阳性，生物型为c 型。噬菌体－ 生物分型结果显示，6株分离株全部为1c 流行株。

图 1

注: M: Marker; 1: HI2008027; 2: HI2008028; 3: HI2008029; 4: HI2008030 ( 小川型) ; 5: HI2008031; 6: HI2008032; 7． 阳性对照; 8． 阴性对照。 图 1 6株霍乱弧菌ctxA 基因PCR 扩增结果

6株菌均在308 bp 处有阳性条带出现，表明6株菌均为产毒株。

图 2

图 2 5株O1群霍乱弧菌PFGE 分型聚类分析

6株菌中，有5株菌经Not I 酶切，PFGE 图谱命名为CN0726，有一图谱因条带部分弯曲有差异而命名为CN0727，但聚类图谱分析相似性为100% (图 2) 。 另外1株因不纯未做分析，此株菌患者的密切接触者及其家用厕所分离株分别为HI2008028和HI2008029。

结果显示，6株菌均对链霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑、多黏菌素B 耐药; 对诺氟沙星、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢唑啉、庆大霉素、四环素、阿米卡星、妥布霉素、强力霉素均敏感; 5株对环丙沙星、氨苄西林、卡那霉素敏感; 3株对氯霉素敏感。

分析结果显示，引起这起霍乱疫情的流行菌型是O1群埃尔托霍乱弧菌稻叶型流行株(1c) ，尽管有1株为O1群小川型，但从相同的噬菌体－ 生物型，相同的PFGE 型结果来看，可能是菌株在个体的进化过程中发生了部分表型变异，其发生的变异并未影响到NotⅠ酶切位点，或者是基因表达的开闭所致^〔4〕。

O1群埃尔托霍乱弧菌可分为流行株和非流行株，流行株致病力强，具有流行和大流行的潜力，非流行株存在于自然水体中，一般不致病或仅引起散发的腹泻病例。噬菌体－ 生物分型是区分两类不同菌株和不同来源菌株菌型很好的常规方法，可作为追溯传染来源、传播途径和分析流行形式的流行病学工具之一^〔1〕。霍乱毒素(CT) 基因检测也可区分两类菌株，有无CT 基因是流行株与非流行株的根本区别^〔1〕。本实验6株分离株均为1c 流行株，且均为产毒株，提示分离菌株均来自同一传染源。

PFGE 是近几年来人们为了追踪传染来源和传播途径而建立起来的分子分型技术之一。5株分离株PFGE 分子分型实验结果显示，其中4株的PFGE 图谱相同，命名为 KZGN1101． CN0726; 另1株因图谱条带弯曲，不同于其他株，而命名为KZGN1101． CN0727。可能是由于该分离株在进化过程中首先发生改变的位点影响了Not 酶切位点，但尚未影响到功能基因的表达^〔4〕，聚类图谱分析相似度仍为100%。 因此，从分子角度可以确认菌株来自同一克隆，并进一步证明该起疫情是由O1群埃尔托霍乱弧菌稻叶型流行株(1c) 引起。由于聚餐所使用的餐具以及剩余食物等已进行处理，未采集到可疑食物，无法证明本次霍乱暴发疫情的病原菌来源。

药物敏感性实验结果显示，实验菌株对诺氟沙星、头孢噻肟、头孢噻吩等大多数抗生素100% 敏感，可作为病例和带菌者的治疗指导用药，对链霉素、复方新诺明、多粘菌素B、磺胺异噁唑100%耐药，不宜使用。CLSI^〔3〕指出，磺胺异噁唑可以代表当前任何一种磺胺类制剂，提示此次疫情分离株对所有磺胺类药物全部耐药。对复方新诺明100% 耐药的结果与广东省2006-2008年O1群稻叶型霍乱弧菌产毒株结果一致^〔5〕。为减少耐药菌株产生，为选择合适抗生素，有必要加强对霍乱弧菌的耐药性监测，以达到指导临床对霍乱病人及带菌者及时治疗，缩短病情，切断传播途径，快速控制疫情等目的。

志谢 感谢本中心苏新元医师提供的资料以及海口市人民医院、海口市疾病预防控制中心实验人员辛勤的工作和上送的菌株