水痘病毒是儿童期水痘的病原体，其潜伏后再感染表现为带状疱疹，因而水痘病毒又称水痘－ 带状疱疹病毒(varicella-zoster-virus，VZV) 。近年来从基因学上探索不同毒株间的差异及基因分类很受关注，VZV 病毒虽然只有一个血清型，但是不同毒株之间仍存在着变异，其基因组变异率为0.05% ～ 0.06%，与人类基因组变异率0.078% 相近^〔1〕。为了解辽宁地区VZV 基因型别的分布特点，本研究对7例临床诊断为水痘患者的咽拭子进行了聚合酶链反应(PCR) 分析和序列测定。现将结果报告如下。

2009年12月份选取沈阳市传染病院临床诊断为水痘患者7例，分别采集咽拭子标本，编号为VZV-001 ～ VZV-007; 同时采集患者血清标本进行VZV IgM 抗体检测。 所有标本均置于－ 80 ℃保存。

ELISA 试剂盒(德国维润(塞润) 试剂公司) ; DNA 提取试剂盒、TaqTM试剂盒、质粒pMDl9-T、大肠埃希菌JM109感受态细胞(日本TaKaRa 公司) ; PCR 纯化试剂盒 (美国Qiagen 公司) ; 2%琼脂糖凝胶(美国Promega 公司) 。

采用抗体捕捉酶联免疫吸附实验(ELISA) 检测病人血清中水痘IgM 抗体，均按试剂说明书操作。

(1) 核酸(DNA) 提取: 使用 DNA 提取试剂盒从咽拭子标本中直接提取VZV 的DNA。按试剂说明书操作。上游引物vzv-p22R1f: 5'-GGGTTTTGTATGAGCGTTGG-3'; 下游引物vzv-p22R1r: 5'-CCCCCGAGGTTCGTAATATC-3'，特异性扩增ORF22基因37837 ～ 38283之间447个核苷酸片段^〔2〕。(2) 目的片断扩增: PCR 扩增试剂采用TaqTM 试剂盒。PCR 反应条件: 94 ℃ 预变性3 min; 94℃变性1 min，55℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环; 72 ℃延伸10 min。阳性对照株来源于国产长春祈建水痘疫苗。

采用PCR 纯化试剂盒回收阳性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 产物，将回收产物与质粒 pMD 19-T 载体按常规方法连接，然后转入大肠埃希菌JM109感受态细胞，通过PCR 进行蓝白斑筛选和菌落初步鉴定。鉴定为阳性的克隆菌株送北京三博远志生物技术有限责任公司测序，测序结果在GenBank 中用Blastn 进行比较分析。基因型判定依据文献〔2〕，VZV 病毒基因ORF22在37837 ～ 38283位点之间有6个位点可准确的将VZV 分为E、J、M1和M2等4个基因型。6个位点分别为37902、38019、38055、38081、 38177、38229; 其中E 基因型在6个位点的碱基依次为A、G、 T、A、G、A，代表株为Dumas 株; J 基因型依次为G、G、C、C、A、 A，代表株为p-Oka 株; M1基因型依次为A、G、T、C、G、A，代表株为CA123株; M2基因型分为3个亚型，也依据这6个位点的碱基不同而分型。

序列资料以标准图形文件(.ab1 ) 格式保存，使用Sequencher4 .0 .5软件 (GeneCode，Ann Arbor，Michigan，USA) 整理序列资料，从Gen-Bank 数据库下载VZV 各基因型参考株的序列资料，采用 MEGA 3.1软件进行相关对比分析。

图 1

注: 1 ～ 7: VZV － 001 ～ VZV － 007; + : 阳性疫苗对照 图 1 7份咽拭子标本扩增产物琼脂凝胶电泳图

(1) IgM 抗体: 按照试剂盒结果判定标准，7例患者血清标本的吸光度值均大于临界值(cutoff) 上限，判定为水痘IgM 抗体阳性，表明7例患者均为实验室确诊病例。(2) 扩增产物: 7份咽拭子标本中，VZV-001、002、005等3份标本的PCR 产物在约447 bp 处均有一明显的特异性条带，鉴定为水痘病毒。

图 2

图 2 3株水痘－ 带状疱疹病毒辽宁分离株与Dumas 株、p-Oka 株核苷酸序列对比

对PCR 扩增阳性的3株 ORF22基因37837 ～ 38283之间447个核苷酸位点进行序列测定和分析，结果显示，VZV-002和VZV-005基因序列完全一致，且在37920位点的碱基由C 代替了A; VZV-001序列在38036位点和38070位点的碱基分别由C 代替了T，G 代替了A。提示其基因可能发生了点突变。与GenBank 上公布的Dumas 株和P-Oka 株序列进行比较的结果显示(图 2) ，与 Dumas 株序列比较，3株分离株在6个关键位点上有4个核苷酸不同，与P-Oka 株则完全一致，据此判定本研究鉴定的3株水痘－ 带状疱疹病毒的ORF22基因为J 基因型。

图 3

图 3 2009年辽宁省水痘－ 带状疱疹病毒与参考株的基因亲缘关系

将3株VZV 分离株的ORF22基因序列与GenBank 上4个基因型21株参考株的对应序列构建系统进化树，结果显示，系统进化树明显分为E 和J2个分支，其中3株分离株与J 基因型参考株最为接近，与水痘－ 带状疱疹病毒P-Oka 株的同源性为99.56% ～ 99.78%，进一步表明辽宁省目前流行的VZV 为J 基因型。

VZV 属于疱疹病毒科(herpes) ，α-疱疹病毒属，人类疱疹病毒3型，即HHV-3型。其引起的水痘在世界范围内均有发生^〔3〕，易在无免疫力的儿童中形成爆发流行^〔4〕。水痘至今仍未纳入我国法定传染病管理，因此实验室缺乏VZV 病原学资料，特别对VZV 的基因型别研究基本上处于空白阶段。

不同VZV 株间的遗传变异主要表现为单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP)^〔5〕。世界上各实验室在 SNP 分析的基础上选择不同的方法对VZV 的基因型进行命名^{〔2, 6, 7〕}，因此对VZV 基因型的命名至今仍不统一。目前公认的将VZV 基因分为E(European 型) 、M(mosaic 型) 和J (Japanese 型)^〔2〕。近2年来Loparev 等人^〔8〕又将ORF22结合 ORF21或ORF50的序列进行SNP 分析将E 基因型分为E1和E2两个亚型，将M 基因型进一步划分为M1、M2、M3、M4等4个亚型。中国关于VZV 基因分型的报道很少，仅Loparev 等^〔2〕人2004年报道从中国南方(广东等地) 收集的3份临床标本均为M 型，从中国北方(山东等地) 收集的3份临床标本均为E 型。杨吉星等^〔9〕人2008年报道的上海地区1株VZV 基因型为J 型，周小勇等^〔10〕人2009年报道的武汉地区78株 VZV 基因型也为J 型。本研究分离的辽宁省3份临床标本均为J 型，与上海和武汉地区流行株基因型别一致。虽然3个地区均检测出有J 基因型VZV，但并不排除之前报道的E 和 M 基因型仍在流行。流行病学调查结果表明，本研究中的3例阳性患者在发病前1个月均无水痘疫苗接种史，因此认为，目前J 基因型野病毒正在辽宁省流行。

本研究结果显示，3份阳性标本基因序列中，有3个位点出现碱基代替提示该基因可能发生了点突变，也可能是由于限制性内切酶(Taq 酶) 缺少3'-5'校对功能导致复制出现错误^〔9〕。其原因还有待更深入的研究。