登革病毒(dengue virus，DEN) 属黄病毒属^〔1〕，为单股正链RNA 病毒^〔2〕，可导致登革热和登革出血热。登革病毒病流行于热带和亚热带地区，每年约有5 000 万至1 亿人感染，已成为全球公共卫生关注的焦点之一^〔3〕。登革热的诊断目前主要依赖病毒分离培养以及血清中特异性IgM、IgG 抗体测定，但是所耗时间长，在早期诊断中受到一定限制^〔4〕。而常规PCR 方法扩增产物需要凝胶电泳检测，易造成实验室交叉污染。本研究拟建立可对登革1 型病毒感染进行早期诊断的更省时、特异的荧光定量PCR 方法。现将结果报告如下。

登革病毒1-4 型毒株标准株 (DEN-1 夏威夷株、DEN-2 新几内亚株、DEN-3-H87 株和DEN-4-H241 株，均由本实验室保存) ; 登革1 型病毒感染者临床标本(广州市第八人民医院) ; 乙型脑炎减毒活疫苗(成都生物制品研究所) 。

普通PCR 反应试剂、荧光定量 PCR 试剂、RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒(大连TAKARA 宝生物公司) 。Mx3005p 荧光定量PCR 仪(美国Stratagene 公司) 。

从GenBank 中下载80 株不同年份和不同地区的登革1 型病毒基因组全序列，登革2、3、4 型病毒以及黄病毒属其他病毒均分别下载10 株，用Clustal W 进行比对，寻找保守序列。使用BeaconDesigner 7.0 软件设计引物探针，由大连TAKARA 宝生物公司负责合成。上游引物: 5'-GATGAGATCCAG ATGGAGTAGAAAG-3'; 下游引物: 5'-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3'; 探针: 5'FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3'。保守基因(80bp，位于编码非结构蛋白基因NS2A 处) 由Takara 公司合成至 pMD18-T 载体中，命名为PMDns2a。登革病毒总引物探针参见文献〔5〕。常规PCR 登革1 型引物参见文献〔6〕。

(1) 反应体系: 取2 μL DNA，上、下游引物、探针、参比染料Rox reference Dye II 各 0.5 μL，Ex taq 酶预混液12.5 μL，加去离子水至总反应体积 25 μL。扩增条件: 95 ℃ 30 s 预变性; 95 ℃ 5 s 变性、60 ℃ 20 s 退火延伸，40 个循环。(2) 引物与探针最佳浓度优化: 以相同浓度质粒为反应模板，引物浓度(10 μmol /L) 不变，引物量从0.2 ～ 0.6μL 以0.1 μL 递增; 探针浓度(3 μmol /L) 不变，探针量从0.2 ～ 0.7 μL 以0.1 μL 递增; 采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。

提取质粒PMDns2a 并且线性化后 10 倍倍比稀释，依次从10¹⁰ copies /mL 稀释到10⁴ copies /mL。 各取2 μL 进行荧光定量PCR，用去离子水做空白对照。

参照文献〔7〕，用建立的荧光定量PCR 方法对登革1-4 型病毒标准株以及乙型脑炎减毒活疫苗株进行检测。线性化后的 PMDns2a 质粒10 倍倍比稀释6 个浓度，从1.01 × 10⁷ 稀释到 1.01 × 10² copies /μL，分不同的时间重复3 次，每次做3 个重复孔，验证重复性和再现性，变异系数(即相对标准偏差 RSD) 需＜ 25%^〔8〕。此外，对PMDns2a 质粒进行10 倍倍比稀释，荧光定量PCR 检测比较其敏感性。

对广州市第八人民医院提供的cDNA 标本进行荧光定量PCR 检测，用登革病毒总引物探针进行验证，并且根据Ct 值对荧光定量PCR 方法以及常规PCR 方法进行比较。荧光定量PCR 检测以Ct 值＜ 37 并且扩增曲线呈 S 型为阳性判定原则^〔9〕。其中Ct 值＜ 35 且扩增曲线良好可直接判定为阳性，Ct 值为35 ～ 37 需要重复实验。2 次实验均能得到良好S 型扩增曲线方可判定为阳性。根据该标准可确定检测标本是否为阳性，并且可计算阳性率。参照文献〔10〕 将Ct 值分为4 类对结果进行分析，即＜ 25，25 ～ 29.9，30 ～ 34.9，≥35。

应用SPSS 13.0 软件进行统计分析。配伍组资料采用随机区组设计资料的方差分析(two-way ANOVA) ，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

上、下游引物的量分别为0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6μL; 探针量为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μL。通过对同一浓度模板、不同浓度引物和探针的扩增结果进行比较，发现当探针量和引物量均为0.5 μL 时，Ct 值最小，荧光强度增加值(△Rn) 较高，故本实验采用引物量和探针量均为0.5 μL。

荧光定量PCR 标准曲线相关系数R² = 0.999，扩增效率Eff = 96.5%，回归方程Y =-3.410logX + 45.10(Y 为Ct 值，X 为模板浓度) ，表明标准曲线的Ct 值与初始浓度有较好的线性关系。

对登革1 型病毒提取核酸的扩增结果为阳性，而对其他3 型登革病毒以及乙型脑炎病毒提取核酸的扩增结果均为阴性，表明所建立的针对登革1 型病毒的荧光定量 PCR 方法不会受到其他3 型登革病毒和乙型脑炎病毒干扰。

表 1

表 1 重复性测量结果统计分析

表 1 重复性测量结果统计分析

表 2

表 2 不同浓度的Ct值均值及变异系数

表 2 不同浓度的Ct值均值及变异系数

结果表明，配伍设计有效 (F = 2 539.037，P ＜ 0.001) ; 而3 个重复孔之间结果无明显差异(F = 0.814，P = 0.471) 。各个浓度的Ct 值均值及变异系数分析结果表明，重复性标准差(SDr ) 为0.04 ～ 0.42，再现性标准差(SD^R ) 为0.098 ～ 0.29，变异系数＜ 2.5%，方法具有良好的重复性和再现性。

本研究建立的荧光定量PCR 方法检测，敏感性可达到1 copy /μL。

表 3

表 3 临床标本不同检测方法的比较

表 3 临床标本不同检测方法的比较

采用登革病毒种特异引物探针和本研究建立的登革1 型病毒型特异引物探针对166 份 cDNA 样本进行荧光定量PCR 检测，均发现126 份为阳性，阳性率均为75.9%，Ct 值为20.84 ～ 36.36，浓度范围为1 ～ 1.3 × 10⁴ copies /μL; 常规PCR 方法检测到其中36 份为阳性，阳性率为21.7%。表明设计的引物探针对登革1 型病毒检测的敏感性和特异性较高，可适用于临床样本的早期快速检测。

本研究通过对4 个血清型的登革病毒基因组序列同源性分析，发现登革1 型病毒在非结构蛋白基因NS2A 处有一段 80bp 的保守序列，而且该段基因序列与登革病毒其他3 型及其他黄病毒属之间存在较大差异。设计的引物探针经研究证实与其他3 型病毒及乙脑病毒间不存在交叉反应，显示出较高特异性，而且敏感性可达1copy /μL，与Isabelle^〔7〕的报导结果接近。验证试验的Ct 值差异小，表明该方法稳定性较好。 以阳性质粒制作的标准曲线回归方程Y =-3.410logX + 45.10，相关系数R² = 0.999，扩增效率EfF = 96.5%，可根据此标准曲线对样品中的登革1 型病毒进行绝对定量。

利用本研究设计的荧光定量PCR 方法对临床标本进行了检测。在166 份标本中，检测出126 份为阳性，而常规PCR 方法只检测出36 份，可见荧光定量PCR 法比常规PCR 法更加灵敏，而且常规PCR 法从病毒核酸提取、逆转录、PCR 反应与电泳，整个过程大约需6 ～ 7 h，而采用本方法仅需3 h 左右，能同时完成多个样本的高通量检测，可实现对临床疑似病例的早期快速检测和鉴别诊断，并具有快速、敏感、特异并可对标本中病毒进行定量的优点。