黄曲霉毒素是黄曲霉菌( Aspergillus flavus) 和寄生曲霉菌( Aspergillus parasiticus) 产生的一组结构类似的代谢产物，是特剧毒生物毒素，具有致畸、致癌、致诱变作用，属于I 类致癌物，主要诱发肝癌^{〔1, 2〕}。Aflatoxin B1 ( AFB₁ ) 广泛存在于粮食、畜禽饲料中，因此对AFB₁ 残留开展有效的快速检测很有意义。WHO、FAD、欧盟、美国等均对AFB₁ 限量制定明确要求，我国也确定了AFB₁ 的检测量^〔3〕。目前已建立的AFB₁ 检测方法有薄层色谱法( thin-layer chromatography ，TLC) 、高效液相色谱、免疫亲和柱荧光光度法、酶联吸附法( enzymelinked immunosorbent assay，ELISA) 、金标法、微柱筛选法等。 这些方法要求对样品进行较繁琐前处理，需要昂贵的仪器并耗费大量人力，无法进行大范围推广。因此本研究建立免疫学定理分析方法，为快速检测提供更好的检测方法。

AFB₁ ( 德国Sigma 公司，纯度≥98.0%) ; N-羟基琥珀酰亚胺( N-hydroxysuccinimide，NHS) ［吉尔生化( 上海) 有限公司］; 羊抗鼠酶标二抗( goat anti-mouse IgG antibody，GaMIgG-HRP) ( 华美生物工程有限公司) ; 黄曲霉毒素B1-羧甲基肟 ( AFB₁-C3-carboxymethyloxime，AFB₁O) ，牛血清白蛋白( bovine serum albumin，BSA) ，鸡卵清蛋白( ovalbumin，OVA) ，AFB₁-BSA 偶联物( 免疫抗原) 和AFB₁-OVA 偶联物( 包被抗原) 等为自制; 其他试剂市售所得，均为AR 级。

洗液( phosphate buffered saline tween，PBST) 为 0.01 mol /L、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saline，PBS) 含0.05% Tween-20; 包被液为0.1 mol /L pH 9.6 的碳酸盐缓冲液( carbonate buffer solution，CBS) ; 封闭液、稀释液为含5%猪血清的PBST; 酶底物为四甲基联苯胺( tertramethylbenzidine，TMB) 的磷酸-柠檬酸缓冲液; 终止液为2 mol / L 的硫酸溶液。

3K-18 高速冷冻离心机( 德国Sigma 公司) ; 超净工作台( 美国Forma Scientific 公司) ; HI9321 酸度计 ( 美国HANNA 公司) ; U-3000 紫外扫描仪( UV) ( 日本岛津公司) ; Bio-Rad-550 型酶标仪( 美国Bio-Rad 公司) 。

SPF 级6 周龄雌性BALB/C 小鼠 [许可证号: SYXK( 豫) 2011-0001]，购自郑州大学医学院实验动物中心，由河南省动物免疫学重点实验室饲养。NS0 骨髓瘤细胞由英国国家动物健康研究院惠赠。

AFB₁-O 的制备根据文献〔4, 5〕报道的原理，参考陈福生等^〔6〕方法。AFB₁-O 与BSA 的偶联: 采用DCC 法合成AFB₁O-BSA 人工全抗原^{〔7, 8〕}。

取高压PBS 溶解 AFB₁-BSA 至50 μg /mL，与等量FCA 混合，充分乳化后免疫6 周龄BALB/c 小鼠3 只/组，免疫2 组，免疫剂量为每只0.2 mL，免疫方式为背部皮下6 点注射。

棋盘法^〔9〕确定包被抗原的最佳浓度，然后按照常规间接ELISA 方法对免疫小鼠血清和杂交瘤细胞培养上清进行检测。

细胞融合: 间接ELISA、间接竞争 ELISA 挑选效价最高、IC₅₀ 最低的小鼠为细胞融合备用鼠，采用50 ug /只的免疫剂量进行腹腔注射式超强免疫。杂交瘤细胞的筛选与克隆: 融合后待细胞，通过间接ELISA 和阻断 ELISA 进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高的克隆化，之后扩大培养、建株、反复冻存与复苏，从而保证单克隆细胞分泌抗体的稳定性。

单克隆抗体的制备: 采用体内诱生法^〔10〕大量制备AFB₁ 单克隆抗体( AFB₁mAb) 。单克隆抗体腹水提纯: 采用辛酸-硫酸铵法^〔11〕提纯腹水，提纯后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE) ，检测纯化效果。

采用间接ELISA^〔12〕测定细胞株上清与腹水的效价。

参照Jibin^〔13〕所述方法测定亲和常数 Ka。用浓度分别为0.1 μg /mL 和0.05 μg /mL 的AFB₁-BSA 包被，加入倍比稀释的AFB₁mAb，再加入GaMIgG-HRP，TMB 显色测A⁴⁵⁰ nm 值，以AFB₁mAb 浓度为横坐标，以A⁴⁵⁰ nm 值为纵坐标，绘出相应的2 条反应曲线，以每条曲线上部平坦段的 A⁴⁵⁰ nm 值作为100%，在曲线上算出50% A⁴⁵⁰ nm 值时对应的AFB₁ mAb 浓度，按照以下公式计算亲和常数 Ka，其中n =^[Ag]t / ^[Ag＇]t，^[Ag]t、^[Ag＇]t 为2 个不同的包被原浓度，^[Ab]t、^[Ab＇]t 为包被原浓度对应的抗体浓度。

用PBS 配置不同浓度AFB₁ 的标准品，用间接竞争ELISA 测定AFB₁mAb 对其抑制率。以抑制率B/B0 为纵坐标( B 是AFB₁ 不同标准浓度的A⁴⁵⁰ 值，B0 是 AFB₁O 标准浓度的A⁴⁵⁰ 值) ，以不同浓度AFB₁ 的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算AFB₁mAb 对AFB₁ 的IC₅₀。

以AFB₁ 的同类药物以及其他类药物作为竞争物，用间接竞争ELISA 测定单抗对各竞争物的 IC₅₀。以单抗对AFB₁ 的IC₅₀ 与各竞争物的IC₅₀ 的百分比为其交叉反应率( cross activity，CR%) 。

采用间接ELISA 方法，按鉴定试剂盒说明进行检测。

最佳的包被浓度采用棋盘实验确定，分别通过单因素实验，确定一抗稀释浓度、酶标二抗稀释浓度，并绘绘制标准曲线。

以最佳AFB₁-OVA 浓度包板，分别取 AFB2、ZEN、赫曲霉毒素等多种真菌毒素做交叉，按1.2.3 方法测定A⁴⁵⁰ ，B/B0( %) 为纵坐标，表示对应浓度的药物对抗 AFB₁ 单抗的抑制率，以各种药物浓度的对数值为横坐标，绘制以上各毒素的竞争抑制曲线，求出回归方程，根据下面公式求出AFB₁ 与其他真菌毒素的交叉反应率:

将肟化后沉淀物做TLC，Rf = 0.8 处是AFB₁ ，Rf = 0.2 处为肟化产物AFB₁O。

利用U-3000 紫外扫描仪在220 ～ 44 nm 波长范围进行扫描，结果表明BSA 的最大吸收峰在278 nm，AFB₁ 在265、365 nm 处有吸收峰，BSA 与AFB₁ 偶联后，两峰叠加在275、365 nm 附近出现吸收峰，表明偶联成功。

SDS-PAGE 电泳结果表明，BSA 的泳动速度大于AFB₁-BSA，说明AFB₁-BSA 的分子量大于 BSA，证明AFB₁ 已分别与BSA 成功偶联。

AFB₁-OVA 的最佳包板浓度为2 μg /mL，酶标二抗的工作浓度为1: 1 000，孵育时间为30 min，孵育温度为37 ℃。

免疫的3 只小鼠血清抗体效价均达到了10^-4 ，获得了较好的免疫效果，3 号鼠血清效价最高; 3 号鼠的IC₅₀ 最低，达到58.923 ng /mL，线性回归方程为y =-0.216 6 x + 0.563 5，相关系数R² = 0.987，符合线性关系的判定标准，故选择3 号鼠为细胞融合备用鼠。

表 1

表 1 间接ELISA 结果

表 1 间接ELISA 结果

可确定最佳包被原1: 3 200 倍稀释时，抗体稀释倍数为1: 16 000。

将筛选出符合要求的杂交瘤细胞，以其细胞分泌液的效价高低为依据。将AFB₁mAb 具有较高的效价细胞挑选出，其中2H5C9 细胞株的上清效价最高为 1: 1.28 × 10⁵ ，以此细胞株做为制作腹水效价的细胞株。

图 1

图 1 AFB1 mAb 的亲和常数测定曲线

2H5C9 所分泌的mAb 与抗原结合达到饱和的50%所需mAb 的浓度分别为0.536、0.273 μg /mL，其亲和力常数Ka 为2.65 × 10¹⁰ L/mol。依据James 等^〔14〕结论，亲和常数为10⁷ ～ 10¹² L/mol 抗体亲和力高，本试验制备的mAb 亲和力较高，适合于ELISA 方法检测。

H5C9 杂交瘤的AFB₁mAb 曲线回归方程为: y =-0.428 6 x + 1.309 8，相关系数为R² = 0.9732，根据回归方程计算出2H5C9 对AFB₁ 的IC₅₀ 为2.58 ng /mL，本试验所获mAb 对AFB₁ 具有很好的敏感性。

AFB₁ mAb 的IC₅₀ 为0.58 ng /mL，与黄曲霉毒素B2 的交叉反应率为1.61%，与其他药物的交叉反应率均＜ 0.05%，表明AFB₁ 与mAb 特异性结合很强，AFB₁mAb 对AFB₁ 及其同系物有较好的特异性。

通过Pierce 公司ELISA 检测试剂盒鉴定，AFB₁mAb 的亚型均为IgG1。

免疫学定量分析方法的建立，主要通过竞争ELISA 法测定AFB₁ mAb 的效价，阻断ELISA 法测定AFB₁ mAb 半数 IC₅₀ ，通过添加回收测定AFB₁mAb 灵敏性，还有AFB₁mAb 特异性，与其他药品的交叉反应率等实验来进行AFB₁mAb 的免疫学鉴定。

本次实验筛选出2H5-F6、2H5-C9、2H9-C3 三株细胞，其细胞培养上清效价在1: 2.0 × 10² ～ 1: 1.28 × 10³ ，其中2H5-F6 细胞株制作的腹水效价为1: 1.28 × 10⁶ ，AFB₁mAb 亲和常数 Ka 为2.65 × 10¹⁰ L/moL，对AFB₁ 的IC₅₀ 为2.58 ng /mL; 与黄曲霉毒素B2 的交叉反应率为1.61%，与其他类药物无交叉反应。实验制备的单抗完全满足检测要求，为以后研制快速检测黄曲霉毒素B1 试剂打下了基础，拓宽了ELISA 方法应用范围。