动物实验证实，过量的锰透过血脑屏障沉积于广泛脑区，导致神经元的毁灭和神经髓鞘的空泡状变性等改变^{〔1, 2〕}，锰中毒和帕金森氏病都与基底节多巴胺能神经元的退行性变性有关^〔3〕。丝裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated-proteinkinase，MAPKs) 参与细胞增殖、分化、转化及凋亡反应，其中胞外信号调节激酶( extracellular-signal-regulated kinase，Erk) 主要参与细胞增殖与分化的调控^〔4〕。本研究以PC12 细胞为模型，观察锰对神经细胞增殖抑制作用特点及此过程中Erk 活化表达的特点，探讨帕金森氏病( Parkinson＇s disease，PD) 相关环境危险因子锰对神经细胞增殖抑制的分子机制。

RPMI 1640 培养液; 10% 小牛血清( 杭州四季青公司) 5% CO₂ 培养箱( 英国Forma Scientif 公司) 去离子水将MnCl₂ ( 美国Sigma 公司) 配制成10 mol /L 的储存液，4 ℃保存。实验分为对照组，不同氯化锰浓度作用的实验组，二甲基亚砜组。

采用四甲基偶氮噻唑蓝( 3-( 4-，5-dimethylthiazol- 2Vyl) -2，5 -diphenyl tetrasolium bromide，MTT 法)^〔5〕取对数生长期的细胞( 细胞密度为1 × 10⁵ ～ 2 × 10⁵ /L) ，接种于 96 孔培养板( 200 μl /孔) 中。MnCl₂ 对细胞增殖的毒性作用以抑制率来反映，其抑制率的计算公式:

取对数生长期的细胞以每孔2 × 104 个接种于24 孔板中以每天活细胞数均值绘制生长曲线，及计算MnCl₂ 对神经细胞生长抑制率。

分别收集实验组和对照组细胞按透 射电镜要求制样并观察。

分别取对照组及实验 组细胞提取DNA，在加有溴化乙锭( ethidium bromide，EB) 的 1%琼脂糖凝胶上电泳过夜，DL-2000 用作分子标志。

一抗Erk1 /2( 兔多抗，美国Santa Cruz 公司) ; 二抗( Erk1 /2 二抗，辣根过氧化物酶标记，羊抗兔，美国Santa Cruz 公司) ; p － Erk 一抗( 鼠单抗，美国Santa Cruz 公司; 二抗( 辣根过氧化物酶标记，羊抗鼠，美国Santa Cruz 公司) 压片成像: 硝酸纤维素膜稍干后，滤膜滴加1 mL 化学荧光显迹液化学荧光发光剂 ( 美国Pierce 公司) ，反应1 min 保鲜膜覆盖，X 光胶片压片，凝胶成像系统测定免疫印迹区带的光密度，预染标准分子量蛋白Marker( 美国Bio-Rad 实验室) ; 标准分子量蛋白Marker ( 美国Santa Cruz 公司) ; Erk 特异性阻断剂PD98059 ( promega) 。

采用SPSS13. 0 软件进行统计分析。组间率 的比较采用χ² 检验，吸光度用x± s 表示组间比较采用t 检 验。免疫印迹法( western blot) 测定蛋白磷酸化水平采用IMAGINGQUANT 数据处理系统分析结果。

表 1

表 1 表1 不同浓度MnCl2 对PC12 细胞的抑制率( %)

表 1 表1 不同浓度MnCl2 对PC12 细胞的抑制率( %)

600、800 μmol /L MnCl₂ 作用4 d 细胞的抑制率分别是 54. 3%、60. 5%，随作用时间的延长和浓度的上升而增强，呈 现时间依赖效应和浓度依赖效应，表现慢性毒作用。实验组 与对照组相比差异有统计学意义( 均P ＜ 0. 01) 。二甲基亚砜 对PC12 细胞抑制作用与对照组比较差异无统计学意义。

各剂量组在24 h 的抑 制率分别为32. 67%、56. 32%和74. 14%，与MTT 法结果相符。

4 d 透射电镜下可见细胞体积明显缩小，细胞膜表面突起消 失，细胞质中有空泡形成，核膜完整但皱缩，核体积缩小，染色 质致密且边集于细胞核周边，表现为细胞凋亡的形态学改变。

图 1

注: 1: 对照; 2: 600 μmol /L MnCl2 作用于细胞3 d; 3: DL － 2000。 图 1 600 μmol /L MnCl2 作用于细胞3 d PC12 细胞 基因组DNA 凝胶电泳

600 μmol /L MnCl₂ 作用3 d 细胞基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳出 现明显梯状条带。

图 2

图 2 不同浓度MnCl2 treated 作用PC12 4 d 时p － Erk 的表达

600 μmol /L MnCl₂ 作用1、2、3、4 d 可见p-Erk1 /2 逐渐降低， 其中2 d 时较对照降低了75%( n = 3，P ＜ 0. 05) ，图 4 中200、 400、600 μmol /L MnCl₂ 分别作用4 d 时，p-Erk1 /2 亦逐渐降 低，400 μmol /L MnCl₂ 作用4 d 时较对照明降低了78% ( n = 3，P ＜ 0. 05) ，MnCl₂ 对PC12 细胞p-Erk 的逐渐抑制作用表 现出浓度和时间依赖效应。使用MEK( Erk1 /2 上游分子) 特 异性阻制剂PD98059 实验结果表明锰通过MEK 磷酸化下游 的Erk，下调p-Erk1 /2( 图 5) ，使细胞增殖抑制。

对锰神经毒作用机理的探讨一直与帕金森氏病的研究相 关^{〔8, 9〕}，提示锰的神经毒作用机制与多巴胺能神经元的损伤 有一定关系^〔10〕。因此我们以多巴胺能的鼠嗜铬神经瘤细胞 PC12 为模型，筛选锰对神经细胞增殖抑制作用的时间及剂量 效应关系。结果表明，MnCl₂ 对PC12 细胞的增殖抑制作用在 低剂量、较长时间段中表现出剂量和时间效应关系。

本研究结果显示，600 μmol /L MnCl₂ 作用4 d 电镜可见细胞凋亡的形态学改变。同样条件下细胞DNA 碎片化，进一步证实MnCl₂ 能够诱导PC12 细胞凋亡。使用MEK1 /2 特异性阻断剂PD98059 后，可以阻断Erk( p44 /42) 的磷酸化，增强锰的毒性，导致细胞死亡，推断此类激酶是一种细胞存活因子^〔11〕。本实验发现600 μmol /L MnCl₂ 作用1、2、3、4 d Erk 磷酸化水平呈逐渐降低趋势，作用2 d 时较对照明显降低了 75%，200、400、600 μmol /L MnCl₂ 分别作用4 d 时，Erk 磷酸化水平亦逐渐降低，400 μmol /L MnCl₂ 作用4 d 时较对照明显降低了78%，表明MnCl₂ 对PC12 细胞ERK 激活的抑制作用呈浓度和时间依赖效应。结果提示锰致PC12 细胞增殖抑制为细胞凋亡，可能与Erk 磷酸化水平的降低有关。