糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常见的微血管并发症，是导致糖尿病晚期死亡主要原因。α-硫辛酸具有强抗氧化作用、保护β细胞，延续β细胞衰减，减轻对β细胞攻击;增强葡萄糖利用，增强胰岛素敏感性，保护神经细胞，药理和临床发现它具有治疗糖尿病及并发症作用。本研究通过建立大鼠糖尿病模型，观察不同剂量α-硫辛酸干预后心肌基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1，TIMP-1)蛋白水平变化，探讨α-硫辛酸对糖尿病大鼠心肌损伤保护作用机制。结果报告如下。

α-硫辛酸(美国Sigma公司)，将α-硫辛酸溶于生理盐水中配成所需浓度。链脲佐菌素(streptozocin，STZ)(美国Sigma公司)。SureStep Plus血糖检测仪(美国强生公司)。果糖胺试剂盒(氮蓝四唑法)(广州标佳科技有限公司)。兔抗鼠MMP-2、MMP-9和TIMP-1抗体(北京博奥森公司)。

健康SD大鼠(辽宁医学院实验动物中心)50只，雄性250～300 g，许可证号: SCXK(辽)2003-2008。空腹12 h后40只以60 mg/kg剂量STZ腹腔一次性注射，另10只注射枸橼酸缓冲液作为对照组。72 h后尾静脉取血测定血糖，将血糖浓度≥16.7 mmol/L大鼠定为糖尿病造模成功，低于此值者弃去。将造模成功36只大鼠随机分为糖尿病模型组、α-硫辛酸低、中、高剂量组，每组9只。糖尿病模型组不予任何干预，α-硫辛酸组分别给予α-硫辛酸15、30、 60 mg/kg灌胃12周。

采用SureStep Plus血糖仪于实验结束前检测空腹血糖。干预给药结束后，大鼠颈动脉取血，离心分离血清(3 h内)，匀浆上清液蛋白，采用比色法检测大鼠血清果糖胺含量。

大鼠20%乌拉坦(5 mL/kg)麻醉，分离颈总动脉，逆行插管到左心室，通过压力换能器记录左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)，左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)，左室内压最大上升速率(left indoor pressure rise rate，+dp/dtmax)和左室内压最大下降速率(left indoor pressure decrease rate，-dp/dtmax)。

采用免疫组化方法，石蜡防脱切片60 ℃烤片90 min，常规脱蜡至水洗，高压热修复抗原，滴加正常羊血清封闭液，滴加1∶ 100稀释一抗，滴加生物素化二抗、组织和细胞抗原免疫组化显色试剂(strept actividin-biotin complex，SABC)、3，3-二氨基苯联胺(3，3 ＇-diaminobenzidine，DAB)显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。对照用磷酸盐缓冲液代替Ι抗。采用CIAS-1000型细胞图像分析系统测量切片MMP-2、MMP-9、TIMP-1累积吸光度值(A)。

采用western blot法，取-80 ℃冻存心肌标本100 mg加入裂解液中剪碎后移入1.5 mL环氧树脂管中，4 ℃ 12 000 r/min离心25 min，取上清液用于蛋白定量。SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压120 V，半干法将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，恒压电泳95 V，室温1 h，4 ℃封闭过夜，按0.1 mL/cm2膜面积加入1 ∶ 500一抗，杂交2 h，封闭液漂洗后按0.1 mL/cm²膜面积加入1 ∶ 500二抗，室温下摇床杂交1 h，漂洗后加显色剂5 min，放射显影。用生物凝胶图像分析系统进行扫描定量。

所有数据均采用(x±s)表示，统计学处理采 用SPSS 11.0软件单因素方差分析，两两比较采用最小显著 差法- t 检验。P ＜ 0.05认为差异有统计学意义

大鼠注射STZ后血糖水平明显升高，糖尿病模型组大鼠呈明显多饮、多食、多尿症状，并伴不同程度精神萎靡。α-硫辛酸组大鼠一般状况较好，症状较模型组明显减轻。3只大鼠未成模，1只大鼠死亡。与对照组血糖［(4.62±1.03)mmol/L］、血清果糖胺［(3.2±0.19)mmol/L］含量比较，糖尿病模型组大鼠血糖［(25.45±3.24)mmol/L］和血清果糖胺含量［(4.43±0.62)mmol/L］明显升高;α-硫辛酸低、中、高剂量组血糖及血清果精胺含量分别为(23.20±4.06)、(4.54±0.24)、(14.25±3.23)、(3.05±0.20)、(20.15±2.13)、(4.14±0.23)mmol/L，较糖尿病模型组大鼠有所改善，尤以中剂量组改善最为明显。

表 1

表 1 α-硫辛酸对糖尿病大鼠心脏功能影响(x±s)

表 1 α-硫辛酸对糖尿病大鼠心脏功能影响(x±s)

α-硫辛酸干预 12周后，与对照组比较，糖尿病模型组大鼠心功能LVSP降 低、LVEDP升高、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低、差异具有统计 学意义(t=5.177，P ＜ 0.05)。与糖尿病模型组比较，α-硫辛 酸各剂量组LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax、-dp/dtmax 不同程度升高、差异具有统计学意义(t=6.024，P ＜ 0.05)，尤 以中剂量组改善最为明显(t=6.281，P ＜ 0.05)。

表 2

表 2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达及MMP-9/TIMP-1比值变化(x±s)

表 2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达及MMP-9/TIMP-1比值变化(x±s)

与对照组比较，糖尿病模型组MMP-2、MMP-9、TIMP-1及 MMP-9/TIMP-1比值均明显降低(t=3.015，P ＜ 0.05);与糖 尿病模型组比较，α-硫辛酸各剂量组MMP-2、MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1比值有不同程度升高，尤以中剂量组升高 最为明显(t=3.815，P ＜ 0.05)。

图 1

注: 1:对照组;2:糖尿病组;3～5: α-硫辛酸15、30、60 mg/kg组。 图 1 MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达

与对照组比较，糖尿病模型组大鼠心肌MMP-2、MMP-9和 TIMP-1蛋白表达及MMP-9/TIMP-1值明显增高(t=4.018，P ＜ 0.05)，α-硫辛酸各干预组大鼠心肌MMP-2、MMP-9和 TIMP-1蛋白表达及MMP-9/TIMP-1值明显低于糖尿病模型 组，尤以中剂量组降低明显(t=5.017，P ＜ 0.05)。

糖尿病心肌病是指糖尿病患者心肌细胞原发性损伤引起广泛结构异常，最终引起左心室肥厚，舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病状态，是导致糖尿病晚期死亡的主要原因之一^〔1〕。本研究结果表明，与对照组比较，糖尿病模型组LVEDP明显升高，LVSP、±dp/dtmax明显降低，提示糖尿病模型组存在心肌舒缩功能损害，α-硫辛酸干预12周后心肌功能得到明显改善，LVEDP降低，LVSP、±dp/dtmax升高^〔2〕。

近年研究表明，细胞因子分泌增多及细胞外基质组成异常在糖尿病心肌病发病中起着重要作用^〔3〕。基质金属蛋白酶(MMPs)与基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)处于动态平衡状态，维持胶原产生与降解之间的平衡。有损伤因子作用于心脏，打破了MMPs与TIMPs平衡，导致胶原纤维降解减少，致使大量胶原在心组织中沉积[4-5]。DCM时细胞外基质变化主要是胶原沉积和纤维化。MMPs是催化细胞外基质降解的主要酶类之一，可以降解除多糖以外的所有细胞外基质成分^〔6〕。MMPs大量分泌可引起弹力纤维及胶原纤维损伤^〔7〕。MMPs降解胶原产生的基质蛋白产物是胶原再生的主要刺激因素。在心肌组织内MMPs和TIMPs维持恰当比例可能更重要。本研究结果表明，α-硫辛酸干预可明显降低心肌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达，改善MMP-9/TIMP-1比值失衡，致使胶原合成减少，纤维化程度减轻，对心肌组织起到保护作用。