中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (1): 40-41   PDF    
引用本文
刘成芳, 殷国荣, 赵瑞君, 孔丽. 弓形虫复合疫苗滴鼻免疫小鼠诱导肠淋巴细胞变化[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(1): 40-41.
LIU Cheng-fang, YIN Guo-rong, ZHAO Rui-jun, et al. Dynamics of intestinal lymphocyte in mice treated with complex vaccine against Toxoplasma gondii by intranasal immunization[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(1): 40-41.
弓形虫复合疫苗滴鼻免疫小鼠诱导肠淋巴细胞变化
刘成芳1, 殷国荣2 , 赵瑞君2, 孔丽1    
1. 山西医科大学解剖学教研室, 山西太原030001;
2. 山西医科大学寄生虫学教研室
收稿日期: 2011-05-28.
基金项目: 国家自然科学基金(30640057)
作者简介: 刘成芳(1977- ),女,山西吕梁人,讲师,博士在读,研究方向:黏膜免疫。
通讯作者: 殷国荣,E-mail:guorongyin@163.com
摘要: 目的 观察弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)联合蜂胶和γ干扰素(IFN-γ)滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导肠上皮内淋巴细胞及其亚群的动态变化。方法 将96只5～6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为免疫组和对照组,免疫组以弓形虫复合疫苗(20μg STAg+40μg蜂胶+1 000 U IFN-γ)滴鼻免疫,对照组以磷酸盐缓冲液滴鼻;分别于滴鼻2次(间隔2周)后第1、2、3、4、6、8、10和12周处死小鼠,分离肠上皮内淋巴细胞(IEL),计数并涂片;免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群水平。结果 免疫组小鼠IEL的T淋巴细胞增生第2周达高峰(2.27×105),之后逐渐降低;在第1、2、3和4周对照组T淋巴细胞数分别为(0.81×105)、(0.74×105)、(0.87×105)、(0.74×105)个,免疫组IEL中T淋巴细胞数分别为(1.79×105)、(2.27×105)、(2.07×105)、(1.69×105)个,2组差异均有统计学意义(F=8.42,P<0.01);IEL中以CD8+T淋巴细胞增生为主,对照组CD8+T细胞水平无明显变化,免疫组CD8+T细胞明显增生,第2周达峰值(50.5%),随后逐渐下降,第1、2、3、4和第6周分别为43.60%、50.51%、44.70%、40.45%、39.73%,与对照组的25.71%、26.37%、29.31%、27.54%、26.35%比较,差异均有统计学意义(F=6.38,P<0.05);第1、2周免疫组CD4+/CD8+比值低于对照组,差异有统计学意义(F=5.74,P<0.05)。结论 STAg联合蜂胶和IFN-γ滴鼻免疫BALB/c小鼠,可诱导肠上皮内淋巴细胞持续性免疫应答。
关键词: 可溶性速殖子抗原     蜂胶     γ干扰素     滴鼻免疫     肠上皮内淋巴细胞    
Dynamics of intestinal lymphocyte in mice treated with complex vaccine against Toxoplasma gondii by intranasal immunization
LIU Cheng-fang1, YIN Guo-rong2 , ZHAO Rui-jun2, et al    
Department of Human Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
Abstract: Objective To observe the dynamics of intestinal intraepithelial lymphocyte subsets in mice intranasaly immunized with soluble tachyzoites antigen(STAg)in association with propolis and gamma interferon(IFN-γ).Methods Ninety-six female BALB/c mice were randomly divided into immunized and control group and immunized with 2 doses of STAg plus propolis and IFN-γ against Toxoplasma gondii and phosphate buffer,respectively,at an interval of 2 weeks.The mice were killed 1,2,3,4,6,8,10,and 12 weeks after the 2nd dose,respectively,and intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL)were isolated and counted.Percentage of CD4+ and CD8+ T cells was determined by immunocytochemistry.Results The number of IEL of the mice in immunized group reached a peak value at week 2(2.27×105)and was significantly higher than that of in the control group during weeks 1-4(F=8.42,P<0.01).The numbers of CD4+ and CD8+T cells were both higher than those of the control.CD8+ T cells was significantly higher at weeks 1,2,3,4,and 6 than those in the control group (F=6.38,P<0.05),while CD4+ T cells in immunized group increased significantly at week 2 and 3(F=5.64,P<0.05). The ratio of CD4+/CD8+ T cells was higher at week 1 and 2(F=5.74,P<0.05).Conclusion The immunization with STAg in association with propolis and IFN-γ by intranasal drip can effectively induce immune responses of IEL.
Key words: soluble tachyzoites antigen     propolis     IFN-γ     intranasal immunization     intestinal intraepithelial lymphocyte    

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种世界性分布的细胞内寄生原虫，可感染人和多种动物，引起人畜共患的弓形虫病，目前尚无有效治疗药物，研制有效的弓形虫疫苗是当务之急〔1〕。经口感染是弓形虫的主要感染途径，诱导黏膜部位免疫应答对阻止弓形虫的侵入有重要意义;口服和滴鼻免疫是主要的黏膜免疫途径，均能诱导保护性免疫应答〔2〕。鼻内免疫只要较少的抗原就能诱导有效的黏膜免疫应答〔3〕。

理想的粘膜佐剂能增强机体免疫反应，而且能使机体获得最佳保护性免疫应答〔4〕。本课题组前期研究发现，弓形虫可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoites antigen，STAg)联合蜂胶和γ干扰素(gamma interferon，IFN-γ)滴鼻免疫可诱导黏膜和系统免疫应答，并可有效抵抗弓形虫感染〔5〕。本研究采用STAg联合蜂胶和IFN-γ(鼻内免疫BALB/c小鼠，进一步观察其诱导肠相关淋巴细胞及其亚群的动态变化。

1 材料与方法 1.1 实验动物及虫株

96只5～6周龄雌性BALB/c小鼠(中国疾病预防控制中心实验动物研究所，实验动物使用许可证号SYXK: 2006-0015)。国际标准强毒RH株弓形虫，本室液氮保存。

1.2 主要试剂与仪器

水溶性蜂胶(京海食监字第13149F号，农业科学院蜜蜂研究所);重组人干扰素γ(国药准字S10980084，上海克隆生物高技术有限公司);考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);兔抗小鼠CD4、兔抗小鼠CD8-α和浓缩型3，3-二氨基联苯胺试剂盒(天津TBD生物公司)。UV-2602型紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司);ZS-2自动板式酶标仪(北京航宇浪琴医疗设备有限公司);TS-1脱色摇床(江苏海门市麒麟医用仪器厂)

1.3 STAg制备

参照文献〔6〕制备STAg，考马斯亮兰法测定STAg蛋白含量，-20 ℃保存。

1.4 动物分组及免疫

将小鼠随机分为对照组和免疫组，每组48只。免疫组小鼠用弓形虫复合黏膜疫苗(20 μg STAg+40 μg蜂胶+1 000 U IFN-γ/只)滴鼻免疫2次，间隔2周;对照组小鼠以20 μL磷酸盐缓冲液滴鼻。分别于末次鼻内免疫后第1、2、3、4、6、8、10和12周，每组各随机处死6只小鼠。

1.5 小鼠肠上皮内淋巴细胞分离

处死小鼠，剪取全部小肠，完整剪取肠管表面的Peyer结(Peyer patches，PP)，冲洗已除去PP的小鼠肠段，磁力搅拌，3000 r/min Percoll密度梯度离心25 min，分离肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes，IEL)。将淋巴细胞浓度调整至1×106个/mL左右涂片，干燥后，纯丙酮固定，-18 ℃冰冻保存备用。

1.6 CD4+和CD8 + T淋巴细胞亚群检测

按文献〔6〕方法进行。

1.7 统计分析

应用SPSS 13.0软件进行方差分析，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 小鼠IEL中T淋巴细胞数量(图 1)
图 1小鼠IEL中T淋巴细胞数量

在整个实验期间，免疫组小鼠IEL中T淋巴细胞数均高于对照组，对照组无明显变化;免疫组从第1周开始IEL中T淋巴细胞明显增生，第2周达高峰(2.27×105个)，随后下降。在第1、2、3和4周对照组T淋巴细胞数分别为(0.81×105)、(0.74×105)、(0.87×105)、(0.74×105)个，免疫组IEL中T淋巴细胞数分别为(1.79×105)、(2.27×105)、(2.07×105)、(1.69×105)个，2组差异均有统计学意义(F=8.42，P ＜ 0.01)。

2.2 IEL中T淋巴细胞亚群水平变化(图 2、3)
图 2小鼠IEL中CD4+T淋巴细胞亚群百分比(%)

图 3小鼠IEL中CD8+T淋巴细胞亚群百分比(%)

iel中以CD8 + t淋巴细胞增生为主，对照组CD8 + t细胞水平无明显变化，免疫组CD8 + t细胞明显增生，第2周达峰值(50.5%)，随后逐渐下降，第1、2、3、4和第6周分别为43.60%、50.51%、44.70%、40.45%、39.73%，与对照组的25.71%、26.37%、29.31%、27.54%、26.35%比较，差异均有统计学意义(f=6.38，p ＜ 0.05)。免疫组cd4+t细胞第2、 3周分别为13.91%、12.73%，明显高于对照组的8.26%、 8.71%，差异均有统计学意义(f=5.64，p ＜ 0.05)。对照组cd4 +/cd8 +比值有轻微变化，但差异无统计学意义。第1、周免疫组cd4+/CD8 +比值分别为(0.26±0.03)、(0.27±0.09)，低于对照组的(0.34±0.07)、(0.31±0.05)，差异均有统计学意义(f=5.74，p ＜ 0.05)。

3 讨论

本研究结果表明，STAg联合蜂胶和IFN-γ滴鼻免疫BALB/c小鼠后，能够有效诱导其IEL增生性反应。CD4+和CD8 + T细胞水平均有明显增高，以CD8 + T细胞的增高为主，且至少可持续至末次免疫后第6周。CD8 + T细胞主要有αα和αβ 2种二聚体的亚类，活化的CD8αβ IEL是抗弓形虫感染的最主要的效应细胞，与黏膜上皮细胞表面的E钙黏着素相结合，可通过快速杀死被感染的肠细胞而发挥抗虫作用〔7〕。表明STAg联合蜂胶和IFN-γ鼻内免疫能有效激发机体肠黏膜部位细胞免疫应答。IEL明显增多是触发机体抵抗和清除弓形虫的主要机制，尤其是具有杀伤活性的CD8 + T淋巴细胞发挥着主要的抗虫作用。Velge-Roussel等〔8〕用弓形虫表面抗原1(SAG1)联合霍乱毒素(CT)滴鼻免疫CBA/J鼠后第15天，检测到IEL的T细胞增生性反应，且CD8 +、CD4+T细胞水平均有增高，同时将致敏IEL过继转移后，能抵抗弓形虫感染，与本研究结果一致。

综上所述，STAg联合蜂胶和IFN-γ滴鼻免疫小鼠后，有效激活了IEL细胞免疫应答，且可持续至末次免疫后第6周，从而为进一步研制安全有效的弓形虫黏膜疫苗奠定了基础。

参考文献
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〔5〕 刘成芳,殷国荣,赵云鹤,等.不同佐剂的复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用[J].热带医学杂志,2009,9(7):715-717.
〔6〕 殷国荣,刘成芳,刘娟娟,等.可溶性弓形虫速殖子抗原联合蜂胶和IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的细胞免疫应答[J].中国病原生物学杂志,2006,1(1):32-35.
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〔8〕 Velge-Roussel F,Marcelo P,Lepage AC,et al.Intranasal immunization with Toxoplasma gondii SAG1 induces protective cells into both NALT and GALT compartments[J].Infect Immun,2000,68(2): 969-972