霍乱(cholera)是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)所引起的烈性肠道传染病，发病急、传播快、波及范围广，自1817年至今已发生七次世界大流行。霍乱弧菌作为霍乱的病原菌，根据菌体(O)抗原不同，已分出200个以上的O血清群，但仅发现产霍乱毒素(cholera toxin，CT)的O1群与O139群霍乱弧菌可引发霍乱的流行。霍乱弧菌是自然水体的正常菌群^〔1〕，是水体生态体系的一部分，与浮游生物特别是桡足类动物存在共生关系。浮游动物特别是桡足类动物对霍乱弧菌的生存、繁殖及霍乱的传播发挥着重要的作用^〔2〕。由于O1群与O139群霍乱弧菌之间缺乏交叉免疫^〔3〕，因此，加强环境水体监测，快速、准确监测出霍乱弧菌，对于霍乱的早期预警和防控对策的制定起到决定性的影响。本研究对环境水体中霍乱弧菌监测方法进行了综述。

霍乱弧菌在水环境中普遍存在，它在水环境中的生存受多种因素影响，如水温、水深、含盐量、降水、营养物质、浮游生物等。在这诸多因素的影响下，水环境中霍乱弧菌为维持生存可形成活的非可培养状态(viable but nonculturable state，VBNC)，亦可形成生物膜，还可依附于浮游生物、与其以共生的状态存在。

细菌的VBNC状态是细菌为适应不利环境条件的一种生存状态^〔4〕。处于VBNC状态的细菌缩成球形，用常规培养方法不能生长繁殖，但仍然处于存活状态并具有代谢活性。细菌VBNC状态是细菌为适应不利环境条件的一种存活状态，并不是指活的非可培养的细菌^〔5〕。水环境中的霍乱弧菌主要以VBNC状态存在，而且形成生物膜的霍乱弧菌也是VBNC状态^〔6〕。有文献报道霍乱弧菌以VBNC状态存在于摇蚊卵块中。摇蚊(双翅目，摇蚊科)，通常被称为“蠓”，在淡水区域广泛存在。以VBNC状态存在于卵块中的霍乱弧菌可以分泌一种降解卵块中胶状基质的酶，阻止摇蚊卵的孵化，制约环境中摇蚊的数量。在摇蚊卵块还可分离到希瓦氏菌、气单胞菌、假单胞菌、微小杆菌，仅发现其中极少数可分泌降解胶状基质的酶。摇蚊卵块可能是霍乱弧菌的一自然贮存宿主，而且霍乱弧菌与卵块间的相互作用可能并非是简单的病原体-宿主的关系^〔7〕。

细菌生物膜是细菌在自然状态下，由附着于无活力或活组织表面的微菌落组成的有组织、结构复杂的细菌群体生态体系^〔8〕。它主要由含水的、自身产生和分泌的细胞外多聚糖构成一个大的聚合体矩阵，及包裹于其中的很多微菌落组成;呈多层次、持续增长、包含有用于营养物质输入和废物输出的通路、液体充盈、管道分离的柱形或蘑菇状三维结构，外观呈膜状;是细菌细胞的功能性联合体^〔9〕。处于生物膜状态的细菌，由于生物膜结构的稳定性，因而大大提高了细菌的存活能力和对不利外界条件的抵抗力，有利于细菌在恶劣环境中的生存。因此，水环境中的霍乱弧菌通过以生物膜形式形成的微环境为其在外界不良条件下的生存提供庇护^〔10〕。有文献报道，霍乱弧菌是海洋微生物食物链的一部分，其生存受到原生动物(食细菌的原生生物)的制约。霍乱弧菌形成的生物膜可通过2种方式来抵挡原生动物的捕食:分泌胞外聚合物、以及依赖于一种抑制原生动物捕食活性的抗原生动物素的分泌。这种抑制作用普遍存在于霍乱致病与非致病菌株。因此，霍乱弧菌在生物膜中可以长期保持生命力。在霍乱流行间期，生物膜可以起到霍乱弧菌“储存库”的作用^〔11〕。

Colwell等^〔12〕通过简单的将浮游动物、大部分的浮游植物及其他＞ 20μm的微粒从水中过滤除去的方法也证明了霍乱弧菌与浮游动物特别是桡足类动物存在共生关系。大量的数据已经表明:浮游动物尤其是桡足类动物对霍乱弧菌的繁殖、生存及传播发挥着重要的作用。

霍乱弧菌环境水体监测不仅要对海水、江河水及霍乱多发地区容易受到污染、或污染后容易造成人群感染的水体进行监测，同时要对海、水产品进行监测。对于监测点获得的样品，应使用适当的、敏感的方法对其进行检测。但是由于环境水体中，霍乱弧菌菌量低或处于VNBC状态或仅仅是被忽略等原因，霍乱弧菌有时不能检测出。目前，霍乱弧菌分离检测有多种方法，如传统分离鉴定方法、分子生物学方法、免疫学方法，应根据样品的种类以及研究的目的进行合适的选择^〔13〕。传统的培养方法被称为细菌学的金标准，特别是需要分离到菌落时。在传统的培养方法中，选择性培养基的使用可以减少大量的工作量，还可以鉴别细菌的种属特性。常用的富集培养基为碱性蛋白胨水(alkaline peptone water，APW)，选择性培养基为庆大霉素琼脂、硫代硫酸柠檬胆盐蔗糖琼脂(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBS)、亚碲酸盐-牛磺胆酸盐明胶琼脂(tellurite taurocholate gelatin agar，TTGA)^〔14〕。之后选取一系列的生化试验鉴定分离的可疑菌落。所选取的生化试验的数量因菌株的来源不同而异。当然，选取的生化试验的数量越多，得到的结果越可靠。之后，通过玻片凝集确定可疑菌株的血清群。虽然传统培养加生化的方法为常规方法，但费时费力。可选用菌落印迹杂交方法快速检测霍乱弧菌。菌落印迹杂交是将细菌菌落的核酸固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，通过杂交快速筛选出感兴趣的遗传组分。常用方法为地高辛标记核酸探针的菌落印迹杂交。当然此方法也是建立在霍乱弧菌是活的、可培养的基础上，但不需要再做生化试验。处于VBNC状态的霍乱弧菌在自然水体中普遍存在，上述方法无法检出。为了降低霍乱弧菌的漏检率，可使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)、霍乱弧菌的直接免疫荧光实验(direct immunofluorescence of Vibrio cholerae，DFA-DVC)．和间接荧光抗体试验(indirect immunoinfluscent assay，IFA)。涂承宁等^〔15〕则进行了多重PCR与PCR-荧光探针法检测外环境霍乱弧菌的比较研究。其多重PCR针对霍乱弧菌的结构蛋白基因toxR与O1群和O139群霍乱弧菌特异菌体抗原设计引物;PCR-荧光探针法则使用中山大学达安基因股份有限公司提供的通用型试剂及分群试剂。2种方法最低检测限均100cfu/mL，具有较高的灵敏度与特异度，在此基础之上还可区分O1群、O139群与非O1群非O139群霍乱弧菌。扈庆华等^〔16〕建立的改良分子信标-实时PCR快速检测霍乱弧菌的方法则针对基因ctxA保守序列设计引物。此方法检测灵敏度可达到DNA为102.4fg/μL;菌液为32cfu/mL或3cfu/PCR反应体系。DFA-DVC方法分2步:首先加入萘啶酮酸后，样品与酵母提取物一起培养，活的、对底物阳性的细胞会变大、变长;然后，取培养液由荧光标记的单抗染色，制作玻片，置于荧光显微镜下观察。黑色背景下，变长的霍乱弧菌细胞会发出明亮的绿色荧光。IFA与使用荧光标记单抗的DFA的区别在于，IFA使用了偶联异羊抗兔免疫蛋白的硫氰酸荧光素(fluoresceine isothiocyanate，FITC)并用偶联牛血清蛋白的异硫氰酸罗丹明作为背景染色。通常，实验条件许可的情况下，可以先选择传统培养和DFA-DVC的方法。之后，PCR验证DFA-DVC阳性的试验样品。如果不需要传统培养的方法，只做PCR及DFA-DVC也可得到可靠的结果。但是，需注意环境样品只做PCR会由于背景增高而出现假阳性的结果^〔17〕。

霍乱弧菌主要通过受污染的水和食物传播，与不严格的环境管理密切相关。没有或缺少安全的水和充分的环境卫生、加上较差的环境状况，是该病传播的主要原因。因此，加强霍乱环境水体监测，可提供环境污染危险性的评价及对传播溯源的分析，为制定霍乱防控对策提供科学依据。通过监测环境水体霍乱弧菌的污染情况还可起到早期预警的作用。另外，在霍乱非流行期，霍乱弧菌以活的非可培养及生物膜状态存在，常规培养无法检测到，这对监测技术研发提出了更高的要求。