藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕猴桃的根，味甘、咸寒、微涩，具有清热解毒、消肿疥、祛风湿的功效。既往常用于抗肿瘤治疗，尤其对消化道肿瘤疗效较佳^〔1〕。有研究显示^{〔2, 3, 4〕}，猕猴桃属其他种类猕猴桃根提取物在体外对肿瘤细胞生长也有抑制作用，因此其药理研究和临床验证受到广泛关注。本研究制备藤梨根乙酸乙酯提取物，观察其对体外培养的食管癌EC109细胞生长、凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制，为其进一步临床应用提供科学依据。

食管癌EC109细胞系由山东省医学科学院基础所惠赠。

免疫组化染色试剂盒、鼠抗人B细胞淋巴瘤/白血病-2基因( B cell lymphoma /leukemia-2 gene，Bcl- 2) 、Bcl-2相关X蛋白( Bcl-2 associated X protein，Bax)单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司) ; RPMI 1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司) ;胰蛋白酶、四甲基偶氮噻唑蓝( 3-〔4，5-dimethylthylthiazol-2-yl〕-2，5 diphenyltetrazolium broide，MTT) 、二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide，DMSO) (美国Sigma公司) 。Fluo-3 /AM荧光探针(美国Molecular probe公司) ;捷达 801系列形态学分析系统(江苏捷达科技发展有限公司) 。

将藤梨根(济南建联药店) 500 g粉碎成20目的粗粉，加8倍水煮2次，每次1 h;过滤浓缩，然后加入乙酸乙酯溶媒萃取3次(每次300 mL) ，回收溶媒，得浓缩物约25 g(含三萜类物质) ;用蒸馏水热溶、过滤，获得滤液供试验用(无菌) 。

食管癌EC109细胞培养在含10%小牛血清、青霉素和链霉素各100 U/mL的RPMI1640培养液中，37 ℃、5%CO₂饱和湿度条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。以DMSO作为溶剂，将藤梨根乙酸乙酯提取物在临用前用RPMI-1640培养液分别配制成不同的浓度，治疗组中藤梨根乙酸乙酯提取物的工作终浓度分别为50、100、200 μg / mL，并设对照组( 0.04%DMSO +细胞) 。

细胞接种于96孔培养板中，每组6个复孔，分别处理24、48、72 h，其他操作参照文献〔5〕，并计算生长抑制率( inhibition ratio，IR) 。

复孔设置及处理同 1.5.1，按文献〔6〕进行各组细胞凋亡率检测。

将经多聚赖氨酸处理的小载玻片置于培养板中，每组设3个复孔。处理同1.5.1，取载玻片按文献〔7〕进行Bcl-2、Bax蛋白表达检测，采用捷达801系列形态学分析系统，每例选取4个视野进行阳性率测定。

在用药后12、24、48 h时相点终止培养。按文献〔8〕检测细胞内［Ca²⁺］i，计算机记录30个细胞的扫描结果并计算出整张照片的平均荧光强度。

应用SPSS 10.0软件进行t检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后各组细胞的A 值(x±s) 和IR( %) ( n = 6)

表 1 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后各组细胞的A 值(x±s) 和IR( %) ( n = 6)

藤梨根乙酸乙酯提取物对食管癌EC109细胞的生长有明显的抑制作用，随着提取物浓度增加或作用时间延长，各治疗组A 值逐渐降低或逐渐增高(t = 3.428 ～ 16.334，P ＜ 0.05，抑制率均逐渐增高，呈现出明显的量-效和时-效趋势。

表 2

表 2 藤梨根乙酸乙酯提取物对EC109 细胞 凋亡率影响(x±s，%，n = 6)

表 2 藤梨根乙酸乙酯提取物对EC109 细胞 凋亡率影响(x±s，%，n = 6)

对照组EC109细胞自发性凋亡率较低，而藤梨根乙酸乙酯提取物可明显诱导EC109细胞凋亡，并呈现出量-效和时 -效趋势。各干预组与对照组凋亡率比较，差异均有统计学意义(t = 5.419 ～ 17.826，P ＜ 0.05) 。

表 3

表 3 藤梨根乙酸乙酯提取物对细胞Bcl-2、Bax 蛋白表达影响(x±s，%，n = 3)

表 3 藤梨根乙酸乙酯提取物对细胞Bcl-2、Bax 蛋白表达影响(x±s，%，n = 3)

Bcl-2、Bax蛋白阳性染色反应为胞浆内见黄色或棕黄色颗粒，亦可定位于细胞膜、核膜。图像分析显示，对照组EC109细胞Bcl-2蛋白表达量较高，而Bax蛋白表达较低。但各干预组随着药物浓度增加和作用时间延长，Bcl-2表达强度逐渐下降，而Bax蛋白表达强度逐渐上升，呈现出量-效和时-效趋势( Bcl-2:t = 3.58 ～ 10.14; Bax:t = 5.047 ～ 11.065，P ＜ 0.05) 。

表 4

表 4 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后细胞内 ［Ca2+］i 变化情况(x±s，n = 30)

表 4 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后细胞内 ［Ca2+］i 变化情况(x±s，n = 30)

对照组EC109细胞内［Ca²⁺］i随培养时间延长无明显变化，而各干预组细胞内［Ca²⁺］i明显升高，随药物浓度增加，升高越明显，12 h达高峰，此后逐步减低，但至48 h仍明显高于对照组，各干预组细胞内Ca²⁺染色荧光强度与对照组比较，差异均有统计学意义(t = 19.45 ～ 48.80，P ＜ 0.05) 。

本研究结果显示，藤梨根乙酸乙酯提取物在体外可以明显诱导EC109细胞凋亡、抑制细胞增殖，表明诱导食管癌细胞凋亡是其抗食管癌作用的重要机制。肿瘤的治疗效果、耐药的产生与细胞凋亡密切相关，细胞凋亡受多种基因精细调控，并通过凋亡相关的信号传导系统介导来实现。Bcl-2和 Bax基因是Bcl-2家族的2个重要的凋亡相关基因，Bcl-2主要通过自身二聚或与Bax等蛋白形成异二聚体来发挥其调控细胞凋亡的功能，而Bcl-2与Bax之间的比值决定着接受凋亡刺激后细胞是否凋亡^〔9〕。本研究结果表明，藤梨根乙酸乙酯提取物可以通过在蛋白水平上调食管癌EC109细胞Bax基因表达，下调Bcl-2基因表达，使Bcl-2 /Bax比值下降来诱导 EC109细胞凋亡，并且其对凋亡相关基因表达调控的强度与本研究中药物作用后细胞凋亡变化的检测结果趋势一致。因此，对凋亡相关基因表达的调控是藤梨根乙酸乙酯提取物诱导食管癌细胞凋亡的分子机制之一。

钙离子作为一种重要的细胞内信号传导的第二信使，在细胞内可从多条途径诱导细胞凋亡^〔10〕。本研究结果显示，各干预组在用药后12 h，细胞内［Ca²⁺］i即明显升高，具有剂量依赖性。此后随时间延长细胞内［Ca²⁺］i降低，但作用48 h时各实验组细胞内Ca²⁺荧光强度仍明显高于对照组。与文献〔11〕报道的Ca²⁺升高与细胞凋亡早期凋亡的启动有关一致。表明藤梨根乙酸乙酯提取物可以通过升高食管癌细胞内 ［Ca²⁺］i诱导食管癌细胞凋亡，亦是其诱导食管癌细胞凋亡的分子机制之一。