碘缺乏影响甲状腺素合成，导致甲状腺功能减退。海马是与学习记忆有关的关键脑区，碘缺乏可损伤海马组织，导致脑发育障碍和学习记忆力减退。有研究表明，信号蛋白蛋白激酶c( protein kinase C，PKC) 信号途径在脑发育及甲减性脑损伤过程中具有重要的作用^{〔1, 2〕}，c-fos、c-jun 也是与学习记忆密切相关的即早基因。本研究分别用低碘饲料及他巴唑诱导，建立大鼠实验性低碘及甲状腺功能减退动物模型，对发育期大鼠海马组织c-fos、c-jun 表达进行观察分析，为碘缺乏、甲状腺功能减退导致脑发育障碍的发病机制研究提供依据。

健康雌、雄性2 月龄Wistar 大鼠45 只( 中国医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK-( 辽) 2003-2009) 。低碘饲料: 碘含量( 14.11 ± 1.958) ng /g，他巴唑5mg / 片( 上海中西药业股份有限公司新冈制药厂) 。标准饲料: 碘含量( 470.5 ± 46.52) ng /g 。

大鼠45 只，雌性30 只，雄性15 只。适应性喂养1 周后( 条件: 照明周期12 h，室温21 ～ 26 ℃) ，按体重将雌鼠随机分成3 组: 碘缺乏组( 低碘组) 、甲状腺功能减退组( 甲减组) 及对照组，每组10 只。

将雌、雄鼠以2∶ 1 合笼，以次日晨发现阴栓或阴道分泌物镜检发现精子者确定为妊娠0 d，记为E0。 低碘组于合笼前1 周开始喂饲低碘饲料，饮去离子水，至仔鼠生后30d。甲减组雌鼠喂饲标准饲料，自E10天给予含他巴唑饮水^〔3〕，剂量为25 mg /dL，至仔鼠生后30 d。对照组喂饲标准饲料，饮自来水

收集生后30 d 仔鼠血清，按免疫放射试剂盒( 天津德普生物技术和医学产品有限公司) 说明书步骤，用γ-放射免疫计数器( 西安核仪器厂: FJ-2008PS) 测定FT₃、FT₄。

将仔鼠在其生后第30 d 时取脑，于冰盘上剥离出2 侧海马，封存于液氮罐中备用。分离细胞浆PKC 取1 /2 海马称重，加粉碎液( 2 mmol /L 乙二胺四乙酸( EDTA) ，10mmol /L 乙二醇乙醚 ( EGTA) ，20 mmol /L Tris-HCL pH7.5，250 mmol /L Sucros) 至 50 mg /mL。超声粉碎20s，间隔20 s，3 次。4 ℃，12 000 r /min 离心1 h，将上清沉淀分开待用。分离细胞膜PKC 用0.5 mL 1%Triton-X100( 含5 mmol /L EGTA，5 mmol /L EDTA) 将沉淀悬起，超声粉碎，4 ℃，12000 r /min 离心1 h，取上清待用。 PKC 活性测定用改良Takai 方法。反应总体积为0.25 mL( 含有20mmol /L Tris-HCL pH7.5，5mmol /L 醋酸镁，30 mmol /L 2-巯基乙醇，0.5 μC ［γ32P］腺嘌呤核苷三磷酸 ( adenosine-triphosphate，ATP) ，海马长时程增强( long-term potentiation，LTP) ，约3 × 10⁵ cpm，100μg 鱼精蛋白硫酸盐为底物) 。反应以加入同位素开始，30 ℃ 水浴中反应3min，以 10%三氯醋酸3mL 终止反应，将反应产物抽滤至滤膜上 ( φ 0.45 μm) ，放入含5 mL 蒸馏水的液闪杯中，Beckman 闪烁计数仪测定其放射活性。

分别取生后30 d 各组仔鼠，用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，左心室插管固定，先用温生理盐水50 ～ 100 mL 灌流，待流出液清亮后，用 4%多聚甲醛200 ～ 400 mL 持续灌流。取仔鼠大脑于4% 多聚甲醛中固定36 ～ 48 h，常规石蜡包埋，行冠状位连续切片，免疫组织化学SP( 即链霉菌亲和素-过氧化物酶法，streptavidin- perosidase SP) 染色法，石蜡切片常规脱蜡至水，滴加兔抗大鼠Ⅰ抗( 美国Santa Cruz 公司) 购自武汉博士德公司，室温孵育90min，滴加羊抗兔Ⅱ抗( 福州迈新生物技术开发有限公司) ，室温孵育10min，二氨基联苯胺( DAB) ( 3，3＇-diaminobenzidine) 显色，蒸馏水终止反应，常规脱水、透明、封片。

参照Paxions^〔4〕大鼠脑图谱，用MetaMorph /DP10 /BX41 图象分析系统( UIC/OLYMPUS，US /JP) 定量分析400 × 镜下30 d 各组双侧背海马CA1 区c-fos、c-jun 免疫反应产物。每组选取10 个观察视野，每个视野选择30 个以上阳性细胞，阳性产物强度应用平均灰度值表示。灰度值越大，则阳性反应物的染色强度愈小，反之则染色强度越大。

采用SPSS 10.0 软件对数据进行统计分析，大鼠体重、血清FT₃ ( 游离三碘甲状腺原氨酸) 、FT₄ ( 游离甲状腺素) 、PKC 活性及c-fos、c-jun 灰度值各组间差异比较采用单因素χ2 分析，两两比较用q 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

表 1

表 1 3 组仔鼠生后30d 时体重和FT3、FT4浓度水平

表 1 3 组仔鼠生后30d 时体重和FT3、FT4浓度水平

对照组仔鼠体重增加较快，活动性强，毛发发育正常; 低碘组和甲减组母鼠受孕率低，死产流产率高，仔鼠体重增加慢，体形小，尾短，行动迟缓，反应迟钝，开眼晚，毛发萌出晚且稀疏。由表 1 可见，生后30 d 低碘组和甲减组仔鼠体重及血清甲状腺激素FT₃、FT₄ 浓度水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01) 。

表 2

表 2 3 组仔鼠30 d 海马组织PKC 活性( pmol /min/mg)

表 2 3 组仔鼠30 d 海马组织PKC 活性( pmol /min/mg)

低碘组和甲减组仔鼠海马组织胞浆PKC 活性分别为( 24.8763 ± 13.7319 ) 和( 26.3420 ± 7.3028) pmol /min /mg，略低于对照组( 36.7758 ± 15.7113) pmol /min /mg，而胞膜PKC 活性( 33.2207 ± 18.3414 ) 、 ( 30.1775 ± 10.4433 ) pmol /min /mg，则稍高于对照组 ( 20.5598 ± 6.3121) pmol /min /mg，但差异无统计学意义(P＞0.05) 。低碘组和甲减组仔鼠海马胞膜与胞液PKC 活性比值分别为( 1.4143 ± 0.3940) 和( 1.1871 ± 0.4325) ，较同日龄对照组( 0.6493 ± 0.2943) 有明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01) ，表明在低碘组和甲减组存在PKC 由胞浆向胞膜的转运过程。

由仔鼠海马组织的免疫组化染色切片观察结果可见，生后30 d 对照组仔鼠免疫反应阳性产物分布在海马组织锥体细胞层、颗粒细胞层及多型细胞层等处，主要沉积在细胞核，少数沉积在细胞浆和细胞膜，多表现为棕黄色或棕褐色点状、颗粒状。低碘组、 甲减组与对照组比较，染色强度弱，染色阳性细胞数减少。与对照组相比，免疫反应产物分布在细胞核中的减少，分布在细胞浆和细胞膜中的相对增多。

表 3

表 3 3 组仔鼠生后30 d 海马组织c-fos、c-jun 灰度值比较

表 3 3 组仔鼠生后30 d 海马组织c-fos、c-jun 灰度值比较

生后30 d 低碘组和甲减组仔鼠海马组织c-fos、c-jun 灰度值均明显高于对照组(P＜0.01) 。提示碘缺乏、甲状腺功能减退可降低仔鼠海马组织即早基因c-fos、c-jun 表达。

甲状腺激素对哺乳动物中枢神经系统的发育有重要作用。碘缺乏影响甲状腺素合成，导致甲状腺功能减退，进而影响学习记忆功能。其主要原因是碘缺乏、甲状腺功能减退对海马结构和功能的影响。蛋白激酶PKC 是一类Ca²⁺、磷脂依赖性的蛋白激酶系统，与神经生长因子的作用有关，在跨膜信号传递过程中起重要作用^{〔1, 5〕}。PKC 向膜的转运可使神经细胞发生损伤^〔6〕，导致脑功能紊乱^{〔7, 8〕}。即刻早期基因 ( IEGS) 与学习记忆调控密切相关^{〔9, 10〕}，c-fos、c-jun 蛋白的合成在学习记忆特别是长时记忆形成的过程中起重要作用^{〔10, 11〕}，神经元可塑性被认为在记忆过程中起关键作用^{〔12, 13〕}，一定剂量的碘可明显促进体外培养海马神经元 c-fos、c-jun 的表达^〔14〕。

本研究结果表明，碘缺乏、甲状腺功能减退可以降低血清游离甲状腺激素水平，低水平的甲状腺素可引起仔鼠海马细胞胞浆PKC 向膜的转位，并使脑发育关键期海马组织即早基因c-fos、c-jun 表达下降，免疫反应产物主要分布在细胞浆和细胞膜，细胞核中表达程度明显低于正常对照组。故认为 PKC 由胞浆向胞膜的转运，c-fos、c-jun 表达程度及分布的变化，可影响海马学习记忆特别是长时记忆的形成，在低碘及甲减性脑损害的形成中具有一定作用。