近年来,湖南省流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)流行以C 群脑膜炎奈瑟菌(Nm)为主^〔1〕,2009年2月,首次从流脑患者身上分离出B群脑膜炎奈瑟菌,2010年在健康人群流脑咽拭子中,同时分离到4株B群脑膜炎奈瑟菌。为掌握湖南省B 群脑膜炎奈瑟菌的分子生物学特征,为有效的预防和控制其流行提供依据,本研究采用传统检验方法和聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)、脉冲场凝胶电泳(pulsedfield gel electrophoresis,PFGE)等方法对上述B群流脑奈瑟菌分离株进行了鉴定和分型分析。现将结果报告如下。

1 对象与方法 1.1 对 象

(1) B群流脑奈瑟菌分离株:5株,其中流脑患者脑脊液培养分离株1株,健康人群监测咽拭子培养分离株4 株。流脑患者为男性,12岁,某中学学生,脑脊液细菌培养分离到革兰阴性双球菌,经湖南省疾病预防控制中心鉴定确诊。 健康人群监测为2010年11月湖南省流脑监测点15~18岁中学生。

1.2 方 法 1.2.1 试剂与仪器

巧克力琼脂平板(广东环凯微生物公司),API NH鉴定试剂卡(生物梅里埃公司),脑膜炎奈瑟菌诊断血清(中国药品生物检定所),各型脑膜炎奈瑟菌阳性对照株(中国CDC传染病所呼吸道病室提供),100 bp Marker (大连宝生物TaKaRa公司)。5%羊血M-H血琼脂培养基 (广东环凯微生物公司)。抗生素12种(英国Oxoid公司):包括青霉素(PEN)、氨苄西林(AMP)、美罗培南(MEM)、米诺环素(MIN)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX)、环丙沙星 (CIP)、氯霉素(CHL)、阿奇霉素(AZM)、利福平(RIF)、复方磺胺甲噁唑(SXT)、左氧氟沙星(LVX);药敏质控菌株:大肠埃希菌ATCC 25922,肺炎链球菌ATCC 49619(湖南省疾病预防控制中心微生物检验科留存)。

1.2.2 菌株培养和生化鉴定

将分离菌株接种于巧克力琼脂平板,置5% CO₂温箱37℃孵育24 h,可疑菌株进一步分纯培养后,取新鲜培养物按说明书接种至API NH鉴定试剂卡上,再置37℃温箱培养2 h,观察结果。

1.2.3 血清学实验

用接种环刮取纯菌与玻片上脑膜炎奈瑟菌诊断血清研磨均匀,轻轻摇动玻片1~2 min观察结果。 先用多价血清进行凝集,阳性后再分别用群因子血清进行凝集实验分群,同时用生理盐水作对照凝集。

1.2.4 特异性基因扩增鉴定

参照文献〔2〕方法,对种属特异性基因CrgA靶基因进行扩增,用以区分脑膜炎奈瑟菌和其他细菌;扩增荚膜多糖(CPS)基因SiaD和Orf,进行脑膜炎奈瑟菌分群。(1)引物序列及预期扩增产物大小:CrgA(总):5'-GCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC-3',5'-CTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT-3';产物大小230bp。Orf-2(A):5'-CGCAATAGGTGTATATATTCTTCC-3',5'-CGTAATAGTTTCGTATGCCTTCTT-3';产物大小400bp。SiaD(B):5'-GGATCATTTCAGTGTTTTCCACCA-3',5'-GCATGCTGGAGGAATAAGCATTAA-3';产物大小450bp。SiaD(C):5'-TCAAATGAGTTTGCGAATAGAAGGT-3',5'-CAATCACGATTTGCCCAATTGAC-3';产物大小250bp。SiaD(Y):5'-CTCAAAGCGAAGGCTTTGGTTA-3',5'-CTGAAGCGTTTTCATTATAATTGCTAA-3';产物大小120bp。SiaD(W135):5'-CAGAAAGTGAGGGATTTCCATA-3',5'-CACAACCATTTTCATTATAGTTACTGT-3';产物大小120bp。(2)反应体系:25μL,其中buffer5μL、dNTP4μL(终浓度200μmol/L)、MgCl23μL、引物3μL(终浓度lμmol/L)、模板2μL、Taq酶lμL(2.5U)。(3)扩增条件:94℃3min;92℃30s,55℃40s,72℃30s;37个循环,72℃10min。经扩增电泳后,在目的片断相对分子量大小的条带处出现阳性条带,同时阴性对照与阳性对照均成立,则判定为该特异性基因阳性,如无条带则判定为阴性。

1.2.5 药物敏感性试验

采用5%羊血M-H血琼脂培养基和最低抑菌浓度(MIC)琼脂稀释法进行分离株对12种抗生素的药物敏感性试验,严格按2010年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的药敏判断标准进行操作和判定。采用大肠埃希菌ATCC 25922进行MIN、CIP药敏试验质量控制; 采用肺炎链球菌ATCC 49619进行另外10种抗生素质量控制。

1.2.6 分离株脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型 参考中国疾病预防控制中心的脑膜炎奈瑟菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准操作方案进行分型。流脑菌株选用Nhe I酶切,200 μL体系,酶切3 h。标准菌株沙门菌H9812选择Xba I酶切,其余参数与流脑菌株相同。电泳条件为:起始脉冲时间:1 s;终止脉冲时间:25 s;电压:6 V/cm;电泳时间:16 h;电泳温度:14℃。 应用BioNumerics (Version 4.0)数据库软件处理PFGE图像,识别图像条带,电泳图像经统一的分子量标准化进行内校准,标定条带位置,必要时进行手工校正。参照文献〔3〕,相同条带> 85%的菌株判定为相同菌株。聚类图类型选择未加权平均组配对方法(unweighted pair group method with averages,UPGMA) ,条带位置差异容许度(tolerance)为1.5%。不同菌株电泳条带的相似性系数采用Dice系数表示。 2 结 果 2.1 菌落特征与生化鉴定

5株分离菌株经CO₂温箱37℃ 孵育24 h后,呈圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、不溶血、稍黏的菌落。分纯培养及API NH鉴定结果显示,关键实验γ-谷氨酰转移酶(GGT)阳性,葡萄糖发酵阳性,果糖发酵、蔗糖发酵、尿酶、脂酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等均为阴性;麦芽糖发酵阳性或阴性。生化培养鉴定结果表明,5株分离株均为脑膜炎奈瑟菌。

2.2 血清学及PCR分群

血清学分群结果显示,5株均为血清多价Ⅰ阳性,B群阳性;聚合酶链反应扩增结果显示,5株均为总CrgA阳性,SiaD (B)阳性,其他群特异性基因均为阴性。表明5株均为B群脑膜炎奈瑟菌。

2.3 药敏结果

所有5株B群脑膜炎奈瑟菌对PEN、AMP、 MIN、CRO、CTX、MEM、RIF、CHL和AZM全部敏感;对CIP仅有2株敏感;对SXT和LVX则各有1株敏感,其中患者分离株为耐多药菌株,对CIP、SXT和LVX均耐药。

2.4 PFGE分型(图 1)

5株B群脑膜炎奈瑟菌株,分为5 个PFGE型,分型呈高度多态性。

3 讨 论

本研究结果显示,湖南省5株流脑患者和健康人群流脑菌株分离株,经纯菌培养和生化试验确认,血清学分群和特异性基因扩增均鉴定为B群脑膜炎奈瑟菌,这是湖南省首次从流脑患者脑脊液标本中分离到B群脑膜炎奈瑟菌。药物敏感性试验结果显示,5株B群脑膜炎奈瑟菌株对PEN、AMP、 MIN、CRO、CTX、MEM、RIF等抗生素均敏感,表明这些药物可以作为临床治疗该群流脑的首选药物。国外已有报道^〔5〕,B 群脑膜炎奈瑟菌引起的流脑病例对青霉素耐药,后经头孢曲松足量治疗后康复,但应引起重视。5株B群脑膜炎奈瑟菌菌株对SXT、CIP、LVX均呈高度耐药,这一结果与邵祝军^〔5〕、 孙健等^〔6〕报道一致,其中的患者分离株呈耐多药性,其致病与耐药机制值得进一步研究。PFGE分型结果显示,湖南省分离到的5株B群脑膜炎奈瑟菌,其基因呈高度多态化,未检出优势PFGE带型。其中的患者分离株的带型与健康人群分离株完全不同,具有较大基因多态性。国外研究显示,携带者分离株呈现基因高度多态性,而病例分离株则集中于少数几个群^〔7〕。湖南省目前虽只分离到的1株患者B群脑膜炎奈瑟菌,但对于今后有可能发生的B群流脑患者分离株的分子生物学分型应给予密切关注,及时发现并提出预警信息,查找危险因素,明确传播途径,追溯传染来源^〔8〕。

志谢 衷心感谢中国中国疾病预防控制中心传染病所呼吸道室邵祝军、高源、周海建、任红宇、徐丽等老师给予的大力支持和悉心指导