中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (12): 1553-1555   PDF    
引用本文
熊习昆, 杨国光, 张静, 李欣, 黄琼, 王凤岩, 黄俊明, 杨杏芬. 守宫木Sauropus androgynus毒理学安全性评价[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(12): 1553-1555.
XIONG Xi-kun, YANG Guo-guang, ZHANG Jing, et al. Evaluatiion of toxicity and safty of Sauropus androgynus[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(12): 1553-1555.
守宫木Sauropus androgynus毒理学安全性评价
熊习昆, 杨国光, 张静, 李欣, 黄琼, 王凤岩, 黄俊明, 杨杏芬    
广东省疾病预防控制中心毒理所, 广州 510300
收稿日期: 2011-03-29.
基金项目: 广东省科技计划项目(2006B20501009)
作者简介: 熊习昆(1963- ),男,重庆人,主任技师,硕士,研究方向:遗传毒理学.
摘要: 目的 研究守宫木的急性及亚慢性、细胞、遗传及免疫毒性并对其作出安全性评价。方法 对守宫木进行小鼠急性经口、大鼠亚慢性经口、细胞、遗传及免疫毒性试验。结果 全成份鲜样匀浆、叶干粉LD50值＞21.5 g/kg,梗干粉小鼠LD50值雌性20 g/kg、雄性23.3 g/kg;大鼠亚慢性经口毒性试验中干粉无明显有害作用剂量(NOAEL)为2000 mg/kg;较低剂量守宫木对细胞生长有抑制作用,较高剂量则出现细胞增殖现象;浓缩除菌滤液剂量相当于含鲜样6×102mg/mL时,染色体畸变急剧增加,剂量达1.2×103mg/mL时,细胞全部死亡;守宫木提取物对BALB/C小鼠脾T、B淋巴细胞体外增殖功能以及肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN-γ)细胞因子的分泌功能均呈抑制作用,而对腹腔巨噬细胞吞噬功能呈刺激性增强作用。结论 守宫木为低毒或无毒类物质,对大鼠无明显急性毒性、亚慢性毒性,对免疫系统有一定毒物兴奋效应。
关键词: 守宫木     毒理学     安全性评价    
Evaluatiion of toxicity and safty of Sauropus androgynus
XIONG Xi-kun, YANG Guo-guang, ZHANG Jing, et al     
Institute of Toxicology, Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention Guangzhou 510030, China
Abstract: Objective To investigate the acute,sub-chronic,genetic,and immune toxicity of Sauropus androgynus and to evaluate its safety.Methods The leaves and stems of Sauropus androgynus were made into fresh homogenate(FH) or dehydrated into pow der(P) for acute and sub-chronic oral toxicity test.The filtered fresh homogenate(FFH),filtered fresh homogenate heated(FFHH),and filtered fresh homogehate concentrated(FFHC) were made for cytotoxicity with neutral red uptake test (NRU),genetic toxicity with mammalian chromosome aberration in vitro,and immune toxicity with 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diaphyl-2,5 diphenyl-2-tetrazolium bromide(MTT) assay and flow cytometer.Results The medium lethal dose (LD50) of FH was greater than 21.5 g/kg·bw and that of P was above 20.0 g/kg·bw.In sub-chronictoxicity test,all the indexes and values were in normal ranges with the treatment of FH,even at the concentration of up to 10.0 g/kg·bw.There were significant decreases in testicle size and weight of male rats treated with P in high concentration and spermatogenic epithelium hypogenesis could be observed with histopathological examination and there was no spermatogenic cell arrayed in sequence.Under the treatment of P at the concentration of 8.00 g/kg·bw,the feed intake,body weight and serum plasma urea nitrogen,creatine,triglyceride of male rats decreased compared to those of the control group.The no observed adverse effect level(NOAEL) value of Sauropus androgynus powder was 2 000 mg/kg·bw.When Chinese hamster(CHL) cells were treated with FFH and FFHH,the cell proliferation was inhibited at low concentration,but promoted at high concentration with NRU test.The treatment of FFHC enhanced chromatid and chromosomeal aberrations in both CHL and V79 cells at 6×102 mg/ml.Compared to that of the the control group,the proliferation ability of T and B lymphocytes and the levels of tumor necrosis factor(TNF) and interferon(IFN)-γ were all inhibited significantly in the rats treated with Sauropus androgynus.The interleukin-2 (IL-2) increased at 10 and 20mg/ml and decreased at 40-320 mg/ml.The percentage of phagocytic cells increased significantly at 20-160 mg/ml and the phagocytic index increased at 10320 mg/ml.Conclusion Sauropus androgynus has no obvious acute oral toxicity,cytotoxicity and genetic toxicity and the fresh homogenate of Sauropus androsynus has no sub-chronic oral toxicity in rats.Hypogenesis and hypoplasia of testis could be observed in rats treated with high concentration of dehydrated powder of Sauropus androgynas.At low concentration of Sauropus androgynus,lymphocytes proliferation could be promoted,but could be inhibited at high concentration,which might be a hormesis phenomenon.
Key words: Sauropus androgynus     toxicity     safety evaluation    

天绿香为大戟科Euphorbiaceae守宫木属中的守宫木Sauropus androgynus L，别名树仔菜、树菜、越南菜、泰国枸杞、五指山野菜、甜菜等，广泛分布于印度、马来西亚、中国等南亚至东南亚地区。曾因用于减肥引人致死的报道，2005年报道该种野菜仍在中国大陆大量种植与销售，在华南乃至全国引起关注〔1〕。本研究从细胞生物学和免疫学等方面，对守宫木的一般毒性、细胞毒性、免疫毒性以及活性物质进行研究，以期获取守宫木急性、亚慢性毒性数据，并了解其可能的毒性作用机制并对其进行初步安全性评价。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 实验动物

SPF级NIH种小白鼠、BALB/C雌性小鼠，体重18～22g，SPF级SD大鼠，体重70～80g(南方医科大学实验动物中心)，许可证号:SCXK(粤)2006-0015。动物实验室为SPF级，许可证号:SYXK(粤)2008-0011，室温(22±2)℃，湿度60%～80%。

1.2 主要试剂

中国仓鼠肺细胞(Chinese hamster，CHL、V79)(上海细胞生物所)。守宫木嫩芽(海南五指山种植基地)，鲜样滤液:取鲜样按每克加1.5mL纯水、25000r/min低温粉碎(匀浆用作鲜样急性及亚慢性经口毒性试验)后过滤，60℃、0.17大气压浓缩，定容，滤膜除菌后备用。滤液相当于鲜样3.2～12g/mL，用作免疫、遗传、细胞毒性试验。守宫木嫩芽干粉:梗、叶分别煮熟、70℃真空干燥，粉碎后过80目筛得干粉，梗干粉相当于鲜样12.59g/g，叶干粉相当于鲜样8.53g/g，用作不同部位急性经口毒性;全株干燥，粉碎后过100目筛得干粉，每克相当于约7g鲜样，用作干粉亚慢性经口毒性试验。

1.3 实验方法 1.3.1 急性经口毒性实验

NIH种小白鼠3群各40只，雌、雄各半，随机将每群小鼠分为4组，分别按剂量21.5、10.0、4.64、2.15g/kg灌胃给予守宫木鲜样、梗干粉、叶干粉。鲜样直接灌胃，梗干粉、叶用蒸馏水分别定容至120、80mL，前者空腹灌胃3次，后者2次，间隔4h，灌胃量为0.4mL/10g，观察2周。

1.3.2 守宫木细胞毒性试验

以超声破碎并加热及不加热(模拟样品的生熟状态)2种方法处理守宫木样品匀浆，用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)依次作二倍稀释，染毒终浓度为40、20、10、5、2.5、1.25mg/mL，在有/无代谢活化系统存在条件下，分别染毒CHL细胞24、48、72h，并以中性红摄入试验测定其细胞毒性。

1.3.3 体外培养细胞遗传毒性实验

以守宫木浓缩除菌滤液，在有/无代谢活化系统存在条件下设1200、600、300、150mg/mL剂量组，分别染毒CHL、V79细胞，2h后进行恢复培养，24h后进行细胞染色体制片。受试物和阴性对照组选取200、阳性对照选取100个分散良好的中期分裂相进行体外细胞染色体畸变分析。

1.3.4 免疫毒性实验

分离BALB/C小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞，脾淋巴细胞与刺激剂(刀豆蛋白ConA和脂多糖LPS)、守宫木提取物(最终浓度为0、10、20、40、80、160、320mg/mL)共培养72h，取上清采用微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)分析白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN-γ)水平，并用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测T、B淋巴细胞体外增殖转化功能;腹腔巨噬细胞与荧光微球、守宫木提取物(最终浓度为0、5、10、20、40、80、160、320mg/mL)于37℃共孵育2h，用流式细胞术检测巨噬细胞吞噬荧光微球功能。

1.3.5 亚慢性毒性实验

实验用大鼠分4组，每组20只，雌雄各半，单笼饲养，每日自由摄食。(1)守宫木鲜样:剂量设计为0、2.5、5、10g/kg，灌胃给予样品，连续90d;(2)守宫木干粉:剂量为0、2.0、4.0、8.0g/kg，将守宫木干粉参入饲料中给予。观察指标包括:一般生理体征、外观、行为、大小便、皮毛等。体重、脏器重量、脏/体比值和食物利用率。常规血液学指标(中期、终期)和血液生化学指标(终期)。各组大鼠主要器官的大体解剖;对照组与高剂量组大鼠部分脏器组织病理学检查。推算无明显有害作用剂量(no observable adverse effectlevel，NOAEL)。

1.4 统计分析

数据采用SPSS 10.0软件进行方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 急性经口毒性观察

给予梗干粉后，21.5g/kg剂量组部分小鼠出现皮肤发紫、行动迟缓、抽搐、腹部胀气等，粪便黑色、成形，死亡小鼠解剖见胃肠胀气。经推算雌性小鼠经口LD50值为20.0g/kg、雄性小鼠为23.3g/kg。给予叶干粉及鲜样后各剂量组小鼠未见明显不良反应，饮食活动正常，观察期内实验动物无死亡，雌、雄性小鼠经口LD50＞21.5g/kg，属无毒级物质。

2.2 细胞毒性实验

不加热/加热守宫木匀浆液，在较低浓度时细胞毒性随着染毒浓度提高而增强，但＞20、40mg/mL剂量组出现细胞增殖现象，并以72h结果更为明显，呈现病理状态下异常增生或增殖。

2.3 体外培养细胞遗传毒性

加热/不加热守宫木非浓缩除菌滤液均未引起CHL细胞染色体畸变;守宫木浓缩除菌滤液1200mg/mL组引起细胞死亡或生长停滞，在600mg/mL组中，对CHL细胞染色体致畸率高，其直接的致染色体畸变率明显高于代谢活化组且染色单体型畸变明显高于染色体型畸变。守宫木对V79细胞的染色体致畸率相对较低，仅600mg/mL组经代谢活化系统作用后的染色体畸变率与阴性对照组比较，差异有统计学意义(χ2=6.44，P＜0.05)，染色单体型畸变率高于染色体型畸变率。

2.4 免疫毒性实验(表 1)
表 1 守宫木提取物对ConA 和LPS 诱导小鼠脾淋巴细胞增殖及Th1 细胞因子影响

与对照组比较，10～320mg/mL组守宫木提取物对T(F=77.020，P＜0.01)、B(F=65.695，P＜0.01)淋巴细胞增殖及TNF(F=38.781，P＜0.01)和IFN-γ(F=95.802，P＜0.01)细胞因子分泌均有明显抑制作用，但10～20mg/mL组守宫木提取物可刺激IL-2表达增加，而40～320mg/mL剂量组IL-2表达又降低(F=5.563，P＜0.01)。守宫木提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能呈刺激性增强作用。

2.5 亚慢性毒性实验(表 2、3)
表 2 不同组别小鼠宫木干粉90 d 喂养终期血液生化学指标比较(±s)

表 3 不同组别小鼠宫木干粉90 d 喂养终期血液生化学指标比较(±s)

守宫木鲜样亚慢性经口毒性试验终期，动物一般生理、生化、血液学指标、病理学解剖指标均与对照组比较无明显差异。守宫木干粉亚慢性经口毒性试验结果表明，各剂量组大鼠体重、饲料摄入量和总食物利用率指标差异均无统计学意义(P＞0.05);大鼠血液学指标检查表明该受试样品90d喂养试验中期血液学指标无异常;试验终期与对照组比较，雌性低剂量组某些血液学指标差异有统计学意义(F=3.153，P＜0.05)，但波动在正常参考值范围。其余指标各剂量组与对照组差异均无统计学意义(P＞0.05)。部分剂量组各脏器重量指标与对照组差异有统计学意义(F=25.895，P＜0.01)，但脏/体比值指标与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。病理组织学检查表明各剂量组肝脏、肾脏、胃、小肠、脾、肺以及雌鼠卵巢均未见明显病理学改变。雄性高剂量组4只(4/9)大鼠双侧睾丸明显较小，约为正常睾丸的1/2，发育不良率为44.44%，与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(F=4.317，P＜0.05);病理组织学检查发现66.67%(6/9)的雄鼠生精上皮发育不良，部分生精小管内生精细胞完全消失，睾丸间质充满淡粉色均染似胶状物，其周边见有空泡。守宫木干粉NOAEL值为2000mg/kg(约相当于鲜样14～15g/kg)。

3 讨 论

Lai等〔2〕人对守宫木能否引起SD大鼠发生阻塞性细支气管炎进行了研究，结果表明守宫木不会引发SD大鼠的肺部损伤。Chang等〔3, 4〕进行的病理研究中认为淋巴细胞尤其是T细胞介导的免疫反应在守宫木诱发的阻塞性细支气管炎发生发展过程中发挥重要作用。这与本次研究结果相符。

本研究结果表明，全成份鲜样及热处理(拟生熟状态下)匀浆除菌滤液对CHL细胞均无染色体畸变作用，但当匀浆浓缩除菌滤液在剂量达到6×102mg/mL时，出现染色体畸变急剧增加现象，降低剂量则正常。这种超大剂量下表现出的遗传毒性可能为守宫木匀浆浓缩除菌滤液影响细胞生存环境与生理功能所致;低剂量守宫木提取物(10～20mg/mL)能刺激IL-2分泌，而相对高剂量守宫木提取物(40～320mg/mL)却表现为明显抑制作用。鲜样经口灌胃达1000mg/kg时，未见明显亚慢性毒性作用;干粉经喂饲90d后，雌雄性高剂量组多个生化指标与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，可能需要更深入研究确定原因。与对照组比较，各剂量组脏器重量指标差异有统计学意义(P＜0.05)，但脏/体比值与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明其重量改变是由于生长迟缓导致。

守宫木中可能存在一种(类)有一定生物学效应的物质，低剂量可刺激免疫系统反应，而相对高剂量却表现为明显抑制作用，呈现出一定小剂量兴奋效应，这种作用在大鼠中不明显，但可能是其引起人类肺部异常的原因。

参考文献
〔1〕 郭巨先,杨暹,郭兰良,等.华南野生蔬菜守宫木的毒理学研究[J].华南农业大学学报:自然科学版,2005,26(4):10-14.
〔2〕 Lai RS,Wang JS,Lee PC.Sauropus androgynus and papaverine donot induce bronchiolitis obliterans in Sprague-Dawley rats[J].Zhon-ghua Yi Xue Za Zhi(Taipei),2000,63(7):536-541.
〔3〕 Xia MH,Huang RL,Kristine LW,et al.Compound cytotoxicity profiling using quantitative high-throughput screening [J].Environ Health Perspect,2008,116(3):284-291.
〔4〕 Collins FS,Gray GM,Bucher JR.Toxicology transforming environmental health protection[J].Science,2008,319(5865):906-907.