吗啡是最常见的鸦片类毒品之一，鸦片类毒品可通过影响细胞免疫功能^〔1〕，改变机体对HIV 的易感性和病毒复制，促进艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS ) 的发病进程^〔2〕。国外流行病学调查发现，在艾滋病病毒携带者或患者中，鸦片类毒品依赖者比非毒品依赖者体内的病毒载量高^〔3〕。静脉吸毒是艾滋病传播的主要方式之一^〔4〕，中国静脉吸毒的主要毒品是海洛因和吗啡，属于鸦片类毒品，但鸦片类毒品本身的药理作用是否会影响HIV-1 病毒的感染或复制而导致静脉吸毒传播是值得深入探讨的问题。有研究表明，MT2 细胞较易感染HIV-1 并稳定传代^〔5〕。因此，本研究应用体外研究方法，建立免疫MT2 细胞病毒培养模型，旨在探讨鸦片类毒品对HIV-1 在MT2 细胞内复制的影响，为鸦片类毒品依赖合并HIV 感染者的免疫防治和宣传教育提供参考依据。

盐酸吗啡注射液(东北制药集团公司沈阳第一制药厂) ，规格为1 mL、10 mg; 盐酸纳洛酮注射液 (国药集团国瑞药业有限公司) ，规格1 mL、10 mg。吗啡使用前以RPMI 1640 培养液(含青霉素10 U/mL，庆大霉素50 μg / mL，10%胎牛血清) (美国Gibico 公司) 10 倍稀释成所需浓度; vironostika HIV-1 Antigen p24 试剂盒(法国生物梅里埃公司) ; 达尔伯克改良伊格尔培养液(美国Gibico 公司) 。

(1) MT2 细胞: 传代人类T 淋巴细胞系 MT2 细胞(美国马萨诸塞大学医学院卢山教授惠赠，军事医学科学院微生物与流行病研究所全军艾滋病检测中心保存)用RPMI 1640 培养基(+ 10%胎牛血清) 培养，1 ～ 3 d 传代1 次。(2) HIV-1 病毒: 属类似泰国B’基因亚型T 嗜性毒株，已在MT2 细胞上稳定传代。该毒株于2008 年11 月从中国河南省1 位35 岁男性艾滋病患者的外周血淋巴细胞分离得到，该患者为性接触感染HIV 者，从未吸食过任何毒品。

将MT2 细胞按单纯随机化分组原则，分为吗啡处理组、吗啡+ 纳洛酮处理组、纳洛酮处理组和病毒对照组，4 组均用类似泰国B’基因亚型T 嗜性毒株HIV- 1 感染。(1) 吗啡处理组: 先用终浓度为10^-12、10^-10和10^-8 mol /L 的吗啡对MT2 预处理24 h，然后加入终浓度为 100TCID₅₀的HIV-1 T 嗜性毒株。(2) 吗啡+纳洛酮处理组: 先加入终浓度为10^-8 mol /L 的阿片受体阻滞剂(纳洛酮) 处理MT2 0.5 h，再用终浓度为10^-10 mol /L 的吗啡预处理细胞 24 h，最后加入等量的HIV-1 T 嗜性毒株。(3) 纳洛酮处理组:先加入终浓度为10^-8 mol /L 的阿片受体阻滞剂(纳洛酮) 处理MT2 0.5 h，然后加入与不含吗啡等量的细胞培养液保持每组细胞等量的培养液和药物浓度，24 h 后加入等量的 HIV-1 T 嗜性毒株。(4) 病毒对照组: 与前3 组在同等时间内加入等量的HIV-1 T 嗜性毒株。保持以上4 组细胞的培养液总量和药物浓度一致，加入HIV-1 感染细胞4 h 后，用RPMI 1640 或DMEM 培养液洗涤细胞3 次洗去游离的病毒。MT-2 细胞感染病毒第4 d，更换1 次含有吗啡和纳洛酮的RPMI 1640 培养液。吗啡和纳洛酮处理的浓度和时间是通过四甲基偶氮噻唑蓝实验后对细胞不产生毒性的浓度，不仅与报道的吗啡和纳洛酮体外实验有可比性^〔6〕，还与吸食鸦片类毒品者血液、尿液样本中的浓度相当^{〔7, 8〕}。

分别于病毒培养第3、4、5、6 d，收集MT2 细胞培养上清300 μL，用ELISA 双抗体夹心法检测 HIV-1 p24 抗原表达量，检测方法按照试剂盒说明书进行。

应用SPSS 13.0 软件进行一般描述性分析和方差分析。

表 1

表 1 不同组别HIV-1 感染MT2 细胞HIV-1 p24 抗原表达量比较( 10-3 μg /mL，x±s)

表 1 不同组别HIV-1 感染MT2 细胞HIV-1 p24 抗原表达量比较( 10-3 μg /mL，x±s)

HIV-1 感染MT2 细胞第3、4、5、6 d，10^-12、10^-10和 10^-8 mol /L 3 个浓度吗啡处理组的HIV-1 p24 抗原表达均高于病毒对照组，差异均有统计学意义(P ＜ 0.01) ; 吗啡+ 纳洛酮处理组、纳洛酮处理组与病毒对照组的p24 抗原表达比较，差异均无统计学意义(P ＞ 0.05) 。

表 2

表 2 不同吗啡处理组HIV-1 p24 抗原表达比 对照组增加倍数值比较

表 2 不同吗啡处理组HIV-1 p24 抗原表达比 对照组增加倍数值比较

图 1

图 1 吗啡处理组比对照组HIV-1 p24 抗原表达增加倍数随时间变化曲线图

第3、4、5、6 d，3 个浓度吗啡处理组的 HIV-1 p24 抗原表达量比对照组增加的倍数比较，差异均有统计学意义(P ＜ 0.05) ; 10^-12、10^-10和10^-8 mol /L 3 个浓度吗啡处理组在不同时间HIV-1 p24 抗原表达量比对照组增加倍数比较，3 个浓度吗啡处理组的HIV-1 p24 抗原表达量比对照组增加倍数均随着感染时间的延长而呈现递增的趋势 (P ＜ 0.05) 。

本研究结果表明，不同浓度吗啡处理组HIV-1 p24 抗原表达均高于病毒对照组，提示吗啡能促进HIV-1 在MT2 细胞内的复制。本研究表明，3 个吗啡处理组的HIV-1 p24 抗原表达量比对照组增加的倍数值均随着感染时间的延长而呈现递增的趋势，提示吗啡的促进作用与时间成“时间－ 效应”关系; 而不同浓度的吗啡的促进HIV-1 在MT2 细胞内的复制程度不同，其中以10^-10 mol /L 浓度的吗啡使病毒复制增加的程度最大，与Li 等^〔9〕研究结果一致。Makman 等^〔10〕研究表明，滥用吗啡能明显降低免疫细胞的免疫调节。因此，吗啡的作用机理可能是在HIV-1 感染MT2 细胞前，降低MT2 细胞的免疫调节，使免疫受到抑制，促使HIV-1 感染细胞的几率增加，从而促进HIV-1 的复制。有研究表明，吗啡通过阿片μ 受体作用于淋巴细胞，可降低NFκB 、TNF-α、MIP-1α 和MIP-1β 等细胞因子的表达以及IL-2 的分泌，从而促进CCR5 或CXCR4 的表达，促使病毒的复制程度增高^〔11〕。本研究发现，含有阿片受体阻滞剂的纳洛酮能阻滞吗啡的作用，提示吗啡可能是通过阿片受体作用于MT2 细胞，从而促进HIV-1 复制。 此结果与Li 等^〔9〕研究结果一致。