1 型糖尿病是一组以血糖水平增高为特征的代谢疾病，由于胰岛素分泌缺陷而引起高血糖和糖尿病。除碳水化合物外，尚有蛋白质、脂肪代谢异常^〔1〕。由于社会发展，人们生活方式改变和人口老龄化，糖尿病发病率及患者总数在全球范围内呈逐渐升高趋势，严重威胁人类健康^〔2〕。浒苔多糖来源于绿藻浒苔(Enteromorpha prolifera) ，主要为水溶性硫酸杂多糖，具有良好的消炎、抗肿瘤、提高免疫力、调血脂和降血糖等活性。本研究通过对1 型糖尿病模型小鼠灌胃不同剂量浒苔多糖，观察氧化/凋亡反应相关细胞因子mRNA 表达水平变化，以探讨浒苔多糖纠正1 型糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱的可能机制。

浒苔多糖(enteromorpha's polysaccharide，EP) (含可溶性多糖57.2%，本研究室采用水提醇沉法制备) ; 四氧嘧啶(美国sigma 公司) ; 盐酸二甲双胍片(北京市永康药业有限公司) ; 血清总胆固醇(total cholesterol，TC) 、甘油三酯(triglycerides，TG) 、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoportein-cholesteral，LDL-C) 、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) 和超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD) 测定试剂盒(南京建成生物有限公司) ; Trizol 细胞裂解液(美国Invitrogen 公司) ; pimeScriptTM 反转录－ 聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR) Kit(日本TaKaRa 生物技术公司) ; 引物由上海生工服务公司合成。安稳血糖测试仪及测试纸(长沙三诺生物传感技术有限公司) ; PTC2000 梯度PCR 仪、电泳仪、电泳槽(美国BIORAD) ; SynGene 凝胶成像系统(德国Hermle 公司) ; Thermo Labsystems MK3 酶标仪(芬兰雷勃公司) 。

雄性清洁级ICR 小鼠(上海斯莱克动物实验中心) 90 只，体重22 ～ 24 g，许可证号: SCXK(沪) 2007-0005，适应性喂养3 d。

糖尿病小鼠模型建立: 小鼠空腹 16 h，随机取8 只作为对照组，其余小鼠腹腔注射四氧嘧啶 (0.22 g /kg) 造模。72 h 后禁食4 h 后，尾静脉取血测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG) ，将FBG≥11.1 mmol /L 小鼠作为糖尿病模型鼠。取造模成功小鼠40 只，随机分为5 组: 模型组、浒苔多糖低、中、高剂量组和阳性对照组，每组8 只。浒苔多糖低、中、高剂量组分别给予浒苔多糖200、400 和800 mg /kg 灌胃，阳性对照组给予盐酸二甲双胍500 mg /kg 灌胃，模型组予以蒸馏水。每天1 次，连续28 d，灌胃期间各组小鼠自由摄食和饮水。末次给药后禁食4 h，摘眼球取血，4 ℃、 3000 r /min 离心10 min，制备血清，－ 20 ℃冻存备用。放血后迅速打开腹腔，分离胰腺，取胰尾，置于－ 80 ℃冰箱，备用。

FBG: 各组小鼠灌胃后禁食4 h，断尾取血，用血糖仪测定FBG 值。血清TC、TG、LDL-C、T-SOD 和 iNOS: 按试剂盒使用说明进行测定。

总RNA 提取: 按说明书操作，作纯度鉴定。引物序列设计: 从NCBI 的Nucleotide 中查得目的基因和内参照基因，由大连宝生物公司合成引物，各对引物序列如下: β-actin 上游: 5'-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG -3'，下游: 5'-GCTGCCTCAACACCTCAACCC -3'，扩增片段266 bp; MnSOD 上游: 5'- AGAGCAGGCAGCAATCTGTAAGC- 3'，下游: 5'-GTGAACAATCTCAACGCCACCG -3'，扩增片段321 bp; Bax 上游: 5'-CGGCGAATTGGAGATGAACTG -3'，下游: 5'-TGGTCACTGTCTGCCATGTGG -3'，扩增片段334 bp; Bcl-2 上游: 5'-ACGAGTGGGATGCTGGAGAT -3'，下游: 5'-GCAGATGCCGGTTCAGGTAC -3'，扩增片段长度465 bp。RT-PCR 试剂盒说明书操作。取5μLPCR 产物与1μL Loading Buffer 混合后，加入1.0%琼脂糖凝胶小孔中，电泳缓冲液为0.5 × 硼酸缓冲液，120V 电压电泳40 min。电泳结果用SynGene 凝胶成像系统GeneTools 3.06 软件进行PCR 产物半定量分析。

采用SPSS 13.0 软件进行统计分析。计量资料用x±s 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较用q 检验，同组之间前后比较用配对t 检验。P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

实验期间模型组小鼠体毛杂乱，倦卧，活动力差; 二甲双胍组小鼠消瘦但活动力较强; 浒苔多糖各剂量组小鼠一般状况良好，毛色光泽，活力较强。随给药时间增加，与模型组比较，浒苔多糖各剂量组及二甲双胍组小鼠饮水量和进食量逐渐减少，与正常对照组接近。第28 d，模型组小鼠摄食量和饮水量最高，浒苔多糖低、中、高剂量组小鼠摄食量和饮水量与二甲双胍组相近，均明显低于模型组。

表 1

表 1 各组小鼠空腹血糖值比较(x±s，n = 8)

表 1 各组小鼠空腹血糖值比较( x±s，n = 8)

实验过程中，模型组小鼠FBG 一直维持较高水平，与0d 相比，28 d 时模型组FBG 明显升高，差异有统计学意义(t = 4.855，P ＜ 0.05) 。 与模型组比较，7 d 时，浒苔多糖低、高剂量组和二甲双胍组 FBG 明显降低，差异有统计学意义(F = 15.878，P ＜ 0.05) ; 14 d 和28 d 时，浒苔多糖各剂量和二甲双胍组FBG 明显低于模型组，差异有统计学意义(F = 16.361、24.427，P ＜ 0.01) 。

表 2

表 2 各组小鼠TC、TG 和LDL-C 值比较 ( mmol /L，x±s，n = 8)

表 2 各组小鼠TC、TG 和LDL-C 值比较 ( mmol /L，x±s，n = 8)

与对照组比较，模型组小鼠TC、LDL-C 和TG 水平明显升高，差异有统计学意义(F = 10.587、2.892、3.588，P ＜ 0.05) ，与模型组比较，浒苔多糖中、高剂量组小鼠TC、TG 值明显降低，差异有统计学意义(F = 10.587、3.588，P ＜ 0.01) ，浒苔多糖高剂量组LDL-C 水平明显降低，差异有统计学意义(F = 2.892，P ＜ 0.05) 。

表 3

表 3 各组之间T-SOD、iNOS 活力比较( U/mL，x±s，n = 8)

表 3 各组之间T-SOD、iNOS 活力比较( U/mL，x±s，n = 8)

与对照组比较，模型组小鼠血清SOD 活力降低、iNOS 活力升高，差异具有统计学意义(t = 2.351、2.901，P ＜ 0.01) ，表明四氧嘧啶致糖尿病小鼠体内氧化应激水平升高。与模型组比较，浒苔多糖中剂量组SOD 活力升高，差异具有统计学意义 (t = 2.351，P ＜ 0.05) ，浒苔多糖高剂量组iNOS 活力降低，差异具有统计学意义(t = 2.901，P ＜ 0.05) 。

表 4

表 4 各组之间Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、 SOD mRNA 表达比较(x±s，n = 8)

表 4 各组之间Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、 SOD mRNA 表达比较(x±s，n = 8)

与对照组比较，模型组Bcl-2 基因表达降低，异有统计学意义(F = 2.986，P ＜ 0.05) 。与模型组比较，浒苔多糖中、高剂量组Bax基因表达降低，差异有统计学意义 (F = 2.802，P ＜ 0.05) ; 浒苔多糖高剂量组Bcl-2基因表达升高，差异有统计学意义(F = 2.986，P ＜ 0.05) ; 浒苔多糖各组和二甲双胍组MnSOD 基因表达升高，差异有统计学意义 (F = 17.136，P ＜ 0.05) 。

以往研究显示浒苔多糖作为一种绿藻多糖具有良好的降低血清血脂水平和抗氧化作用^〔3〕。在动物实验^〔4〕和流行病调查中^〔5〕都发现，MnSOD 活性与糖尿病慢性并发症关系十分密切。本研究结果显示，与模型组比较，浒苔多糖各组SOD 水平升高，iNOS 水平降低，并呈现一定剂量效应关系，表明浒苔多糖可通过调节生物酶水平抑制氧化应激。MnSOD mRNA 表达水平在模型组和对照组之间差异无统计学意义，与牟忠卿^〔6〕研究结果类似，提示MnSOD mRNA 表达水平不受氧化应激反馈性调节，而血清SOD 水平明显下降可能不是由于SOD mRNA 表达水平下降所致，更可能是由于氧化应激产物如 H2O2 对酶活性抑制作用和酶活性基团的糖基化。给药28 d 后，与模型组比较，浒苔多糖各剂量组MnSOD mRNA 表达水平升高，且明显高于二甲双胍组，表明浒苔多糖可通过促进 SOD mRNA 表达从而促进SOD 活性，并抑制iNOS 活性，具有良好的抗氧化应激和抗糖尿病作用。

1 型糖尿病胰岛局部存在β 细胞过度凋亡^〔7〕，Bcl-2 基因家族参与胰岛β 细胞凋亡的发生。本研究结果显示，与模型组比较，浒苔多糖中、高剂量组Bax mRNA 基因表达水平上调，Bcl-2 mRNA 基因表达水平下降，表明浒苔多糖可能通过促进Bcl-2 mRNA 基因表达和抑制Bax mRNA 基因表达，发挥抑制胰岛β 细胞凋亡保护胰腺作用。