类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor,IGF-1)是生长激素(growth hormone,GH)产生生理作用过程中必需的一种活性蛋白多肽,大部分由肝分泌^〔1〕。IGF-1不仅可以作用于正常细胞,而且对癌症形成和发展的每个关键阶段均有影响^{〔2, 3, 4〕}。IGF-1被认为是牛乳发挥其生理功效的主要含量因子之一,而大量的摄入牛奶会导致人体内IGF-1含量增加^{〔5, 6〕}。因此必须对乳及乳制品中IGF-1含量进行分析和监测。本研究对乳及乳制品中类胰岛素生长因子-1ELISA试剂盒检测条件进行优化,以提高检测的准确性和可靠性,为评价乳及乳制品中IGF-1饮食安全,制定食品中IGF-1的卫生标准提供科学依据。

类胰岛素生长因子-1标准品(美国R&D公司),冷冻高速离心机(德国Hermle公司),微量加样器(法国Gilson公司),电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司),酶标仪(瑞士Tecan公司)。

取10只Eppendorf管,向各管中分别加标准品稀释液50μL,向第1、2管中分别加标准品100μL(90μg/L),混匀,然后从第1、2管中各取100μL分别加到第3管和第4管,混匀,再各取50μL分别加到第5、6管中,混匀后从第5、6管中各取50μL分别加到第7、8管中,再次混匀后从第7、8管中分别取50μL加到第9、10管中(稀释后各管浓度分别为60、40、20、10、5μg/L)。将标准品和样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,并设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步骤相同)。用封板膜封板后在37℃下温育30min。小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30s后弃去,如此重复5次,拍干。除空白孔外,每孔加入酶标试剂50μL。再次进行温育、洗涤。每孔先加入显色剂A50μL,再加入显色剂B50μL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15min。每孔加终止液50μL,终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白孔调零,450nm波长测量各孔的吸光度值(A值),测定应在加终止液后15min之内进行。

根据实验原理和潜在的影响因素,选取第1次温育时间、第2次温育时间、显色剂加入量和显色时间等4个影响因素进行单因素试验。第1次和第2次温育时间选取10、20、30、40和60min5个水平进行实验;显色剂A和B的加入量相同,分别选取30、40、50、60和70μL进行单因素实验;显色时间分别选取10、15、20、30和40min进行实验。

试验数据用Microsoft Office Excel 2003软件处理并绘制曲线图。

向微孔中加入标准品,用封板膜封板后置37℃温育,时间分别为10、20、30、40、60min,其余条件不变。随着温育时间的增加,吸光度值开始呈上升趋势,40min之后趋于平行。

加入酶标试剂,用封板膜封板后置37℃温育,时间分别为10、20、30、40、60min,其余操作不变。在40min前温育时间与吸光度值大致为正比关系,在40min处出现最大值,60min处略有下降。

加入显色剂时,A液和B液的用量相同,加入量分别是30、40、50、60、70μL,其余操作不变。结果显示,显色剂的加入量对检测结果的影响大致为钟形曲线,在40μL处出现峰值,50μL处略有下降。

加入显色剂以后,轻轻震荡混匀,37℃避光显色。时间分别为10、15、20、30、40min,其余操作不变。其中10、15、30min处的吸光度值相差不大,30min处出现最大值,40min处下降。

通过以上试验,选取第1次温育时间40min、第2次温育时间40min、显色剂加入量50μL和显色时间30min进行试验,标准曲线的R²为0.9972。

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是将抗体的选择性、酶放大反应的灵敏度和紫外-可见光谱在定量方面的优势结合起来的一种联用技术。此法特异性强、灵敏度高、操作简便,既适合于大批量样本的筛查,也可用于单个样本的测定。但是易受到试剂、样本、加样、温浴、洗版和显色等多种因素的影响^{〔7, 8〕}。在此试验中,根据实验原理、可行性等条件,选取了第1次温育时间、第2次温育时间、显色剂加入量和显色时间作为主要的影响因素进行试验。抗体抗原反应具有很高的特异性,但还是有很多因素影响它们的结合反应。反应时间是重要的影响因素之一。抗原抗体反应需要在一定温度下,经过一定的时间才能达到最佳反应。通过试验确定第1次和第2次温浴的最佳时间均为40min。试剂盒用四甲基联苯胺作为显色剂,经辣根过氧化物酶作用一定时间后显色。显色剂的加入量和显色时间均会影响最后的结果。本试验从操作标准化的角度上考虑,确定显色剂A液和B液的加入量均为50μL,显色时间为30min。通过优化后,试剂盒标准曲线的R²可达0.9972,检测的准确度和可靠性大为提高。