霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的一种以急性水样便为特征的烈性肠道传染病^〔1〕。霍乱弧菌曾引起了7次全球大流行,以发病急、传播快和波及范围广为特征^{〔2, 3〕}。霍乱弧菌的致病因子主要是霍乱肠毒素(cholera toxin,CT),是目前已知的致泻性毒素中最为强烈的毒素,是肠毒素的典型代表^〔4〕。因此,快速而特异地检测出霍乱弧菌,尤其是检测出能够产生CT的霍乱弧菌是疾病控制工作中的重要任务。目前对霍乱弧菌的检测方法主要有分离培养、Dot-ELISA和间接ELISA等免疫学方法,也有报道用常规PCR等分子生物学方法^〔5〕,但均存在着特异性、灵敏度不高,耗时长等缺点。因此,本研究以霍乱毒素基因(cholera toxin gene,ctx)为靶序列建立实时PCR检测方法,为快速检测产毒型霍乱弧菌提供一个可行的方法。

(1)实验菌株:O1群霍乱弧菌10株,O139群霍乱弧菌15株,非O1/非O139群霍乱弧菌10株,其中ctx阳性"的霍乱弧菌25株。副溶血弧菌10株,拟态弧菌4株,溶藻弧菌2株,弗尼斯弧菌1株,沙门菌属细菌5株。(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、传染病预防控制国家重点实验室)。(2)引物和探针的设计:根据ctx的保守序列,用Beacon Designer 7.0软件设计ctx特异性的引物和探针,探针的5'端标记荧光基团FAM,3'端标记淬灭基团BHQ1;扩增片段大小86bp。(3)细菌染色体DNA的提取:本次实验所用细菌的DNA均按照TIANGENDNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)中推荐的步骤进行。(4)实验条件的优化:引物浓度的优化:上下游引物的浓度分别取200、300、400、500、600和700nmol/L6个浓度梯度,探针浓度保持在100nmol/L。每个浓度梯度做5个平行样。在如下的反应条件下用Roche的LightCyclerRealTimePCR扩增仪进行扩增:95℃10s,95℃5s和60℃20s,循环40次。对得到的每个浓度梯度的CT值用SASV8.2版本进行完全随机设计资料的方差分析。探针浓度的优化:探针的浓度分别取100、200、300和400nmol/L4个浓度梯度,上下游引物的浓度保持在200nmol/L。每个浓度梯度做5个平行样。反应条件及统计分析方法同前。(5)实时PCR反应条件:实时PCR采用20μL反应体系,每个反应中含10μL通用PCR反应混合物(Premix Ex Taq^TM,TaKaRa产品),上下游引物(浓度为200nmol/L)各0.4μL,探针(浓度为100nmol/L)0.2μL,去离子水7μL,DNA模板2μL。循环条件为:95℃10s,95℃5s和60℃20s,循环40次,在退火阶段检测荧光。(6)标准品的制备:具体步骤同前。步骤为:用上下游引物扩增霍乱弧菌N16961,PCR产物经胶回收后按照TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒推荐的步骤制备克隆子,挑选阳性克隆子提取质粒,测序确认。用NanoDrop测ctx质粒的浓度分别为62ng/μL换算成拷贝数为2.1×10¹⁰拷贝/μL用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×10¹⁰~1.0×10⁰拷贝/μL,共11个浓度梯度,备用。

(1)实验条件:引物浓度优化:经方差分析后结果显示,6组浓度梯度的CT值差异在总体上差异无统计学意义(P>0.05),同时考虑到随着引物浓度的增高非特异性扩增的可能性就越大,选择上下游引物的浓度为200nmol/L。探针浓度优化:经方差分析结果显示,4组浓度梯度的CT值差异在总体上差异有统计学意义,经SNK法两两比较结果显示,第1组总体的CT值最小,与其他组的差异有统计学意义(P＜0.05)。同时结合荧光曲线发现,随着探针浓度的升高荧光值越来越低。因此选择探针的浓度为100nmol/L。(2)灵敏度评价:用上述反应体系检测ctx"阳性"的霍乱弧菌,结果显示,除阴性对照外,25株霍乱弧菌均呈阳性,灵敏度为100%。(3)特异度检测:用该反应体系检测实验材料中提到的其他菌株,包括ctx"阴性"的霍乱弧菌。结果显示,对该反应体系,除阳性对照外,其他弧菌均为阴性,特异度为100%。

CT是由产毒型霍乱弧菌ctx所编码的,不产生霍乱毒素的霍乱弧菌不致病或者仅引起轻微的腹泻症状,因此,在疫情控制和常规监测中,对霍乱弧菌毒素基因的检测具有重大的公共卫生意义。许多研究建立了ctx的PCR检测方法^{〔6, 7, 8〕},但其特异性尚需优化。本研究建立了针对ctx基因的TaqMan实时PCR检测方法,该方法的检测下限能达到1.0×10²拷贝/μL,远远高于普通PCR1.0×10⁵拷贝/μL的检测下限。同时实验结果证明,该方法具有较高的灵敏度、特异度,能够用于产毒型霍乱弧菌的检测和监测。