细菌的耐药性系全球性问题。抗生素的长期或不合理使用造成严重耐药、多重耐药逐年增加,给抗感染的临床治疗带来了严峻挑战。近年来抗菌药物耐药机制特别是主动外排泵机制的研究为揭示细菌严重耐药、多重耐药性提供了重要信息。现已证实外排泵AcrAB-TolC (efflux pump AcrAB-TolC)广泛存于各种细菌,如大肠埃希菌、沙门菌、产气肠杆菌、志贺菌等^{〔1, 2〕}。本研究综合近年来的研究成果,对外排泵AcrABTolC的结构、外排机制及其调控机制的研究进展作一综述。

外排泵AcrAB-TolC主要由膜融合蛋白(AcrA)、外排转运蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)3部分组成,以三聚体形式穿越细菌内膜和外膜。AcrB横跨内膜,TolC横跨外膜,AcrA包绕TolC与AcrB的外周胞质部分。

AcrA位于外周胞质中,由397个氨基酸组成,其主要作用是包绕TolC与AcrB的外周胞质部分,使之形成一个密封的通道,将物质由胞内运输到胞外。 1999年,Zgurskaya等^〔3〕运用流体动力学和电子结晶学方法确定了AcrA的结构。AcrA是一种拉长的分子,长17nm,高度不对称,轴比为8。其N末端通过脂肪酸酰化连接于内膜,其 C末端的长度和氨基酸序列可变性强,是AcrA与TolC、AcrB结合并相互作用的重要功能区^〔4〕。Touze等^〔5〕研究发现如果其C末端缺失,则AcrA不能与TolC和AcrB结合。Ge等^〔6〕发现,当C末端发生点突变G363C时,AcrA不能与AcrB和TolC聚合,从而使外排泵失去功能。生物化学和基因研究均表明,AcrA是外排泵AcrAB-ToLC中不可缺失的成分^〔7〕。

AcrB广泛存在于革兰阴性和阳性细菌中,其主要作用是摄取和转运物质。2002年,Murakami等^〔8〕破解了AcrB的晶体结构,它横跨细胞内膜,由外周胞质部分和跨膜部分组成。外周胞质部分长7 nm,从侧面看,其上部为一下宽上窄的梯形结构,其顶部直径与TolC底部直径相同,与TolC直接对接。跨膜部分长5 nm,为相对疏松的孔环状结构。AcrB带有12个跨膜α-螺旋和2个大的外周胞质发夹环,2个发夹环分别位于α1和α2以及α7和α8之间,是AcrB底物特异性的主要决定因子^〔9〕。

TolC在革兰阴性细菌中普遍存在,序列相对保守,它可与不同转运蛋白结合,是多种外排泵的外膜通道。2000年,Koronakis等^〔10〕通过X线结晶衍射法了解到其晶体结构,它位于外排泵AcrAB-TolC的最外侧,横跨细胞外膜,长14 nm,由跨膜部分和外周胞质部分组成。跨膜部分含12个β折叠,长4 nm,穿越外膜,向胞外开放,内径为2 nm,为底物排出提供宽阔的通道;外周胞质部分长10 nm,末端α螺旋逐渐螺旋卷曲变细,通过α螺旋卷曲可以象虹膜般伸缩,启闭外膜通道入口^〔11〕。TolC外周胞质部分的α螺旋,尤其是外单环H3、H4与内单环H7、H8的α螺旋是其与AcrA、AcrB相互作用的部位^{〔12, 13, 14, 15〕}。基因研究证实TolC是外排泵AcrAB-TolC中不可缺少的部分,当TolC基因缺失时,细菌对药物的敏感性显著增加^〔16〕。

图 1

图 1 AcrA、AcrB、TolC 的相互作用的外排作用机制〔21〕

外排泵AcrAB-TolC是以质子驱动力为能源,通过AcrB捕获和转运底物,在膜融合蛋白AcrA的协助下,通过底物诱导的构象改变开放AcrB和TolC通道,将底物泵出胞外。外排泵AcrAB-TolC的底物包括抗生素、化学治疗剂、胆盐、染料、去污剂等,对细菌适应外界环境具有重要的意义。但对极性大的物质,如酒精和正丙醇等则不能够通过其外排^〔17〕。

AcrB是外排泵AcrAB-TolC的核心,呈生理不对称的三聚体,每个单体代表转运循环中的一种状态:L (松散),T (紧密),O (开放)。在L状态时,外周胞质孔道开放,底物可进入;T状态时,通道中结合疏水残基的袋蛋白可与底物结合;O状态时,外周胞质孔道关闭,中央孔道开放,可将底物运出^{〔18, 19, 20〕}。TolC是外排泵AcrAB-TolC的外膜通道,在正常状况下处于封闭状态。当有底物与AcrB结合后,首先,AcrB的顶部的2个发夹环与TolC底部的2个发夹环相互作用,引起通道的部分开放,同时,底物与AcrB作用引起其构象改变(LT- O),通过AcrA的C末端β-折叠传导,引起AcrAα-发夹环与TolC的H3、H7α螺旋相互作用,使TolC通道开放^{〔12, 14, 19, 20〕},从而将底物泵出。

图 2

图 2 外排泵AcrAB-TolC 的基因调控示意图〔22〕

当细菌与抗生素等接触时,外排泵AcrAB-TolC被激活,将有害物质泵出胞外,但当其过量表达时,也会将细菌代谢的中间产物排出,这将严重影响到细菌的生存。由此可以推断,细菌中存在外排泵的精密调控机制。综合近年来文献研究发现,对外排泵AcrAB-TolC的调控主要有局部调控和全局调控 2种方式。局部调控蛋白主要为AcrR,全局调控蛋白主要有 MarA,Rob,SoxS,Fis等。

AcrR是一种负调控因子,调控acrAB基因的表达。acrA基因与acrB基因位于同一个操纵元,两基因间无终止信号。acrR基因位于acrAB基因上游141bp,其表达产物AcrR能够与acrAB启动子上的24个碱基对构成的反转重复序列结合,抑制自身及acrAB基因的表达。目前有多项研究证实这一作用。Wang等^〔23〕研究发现,将acrR质粒转移至 acrA超表达耐药株中,可引起acrA表达水平下降;Webber等^〔24〕研究发现,AcrR第45位精氨酸突变,会导致acrAB表达增加;佟海山等^〔25〕发现,在大肠杆菌中,AcrR缺失时,acrAB基因转录水平提高。AcrR的N末端结构相对保守,3个螺旋结构是其与DNA链的结合位点;其C端为底物结合位点,结构差异较大,由不同细菌适应不同环境所致。当AcrR与底物结合后,N端即与DNA链分离,启acrAB基因的表达,外排底物,保护细菌不受侵害。

Hirakawa^〔26〕发现,在大肠杆菌中,AcrS对AcrAB有抑制作用。acrS基因位于外排泵基因acrEF上游,作用是使外排泵AcrEF与外排泵AcrAB间达到平衡。当AcrEF启动时,AcrS表达增加,从而抑制外排泵AcrAB,具体调节机制有待进一步研究。

MarA是一种转录激活蛋白,它可结合于acrAB基因启动子附近DNA结合位点,增强RNA聚合酶与启动子的亲合力,加快起始转录速率,产生大量的AcrA和 AcrB。它也能以同样的方式促进tolC基因的表达。MarA与 MarR呈一种制衡关系。MarA可与marRAB操纵子上游区 marO中的marbox (20bpDNA序列)结合,促进marRAB基因的转录和表达,实现自身激活,同时也促进marR基因的表达。同时,marR基因的表达产物MarR又以二聚体形式结合于 marO基因,抑制marRAB基因的转录和表达,调控细胞内 MarA的水平。MarA-marO结合与MarR-marO结合相互独立,具有一定的竞争抑制。接触大量水杨酸(＞ 5 mmol/L)或四环素(＞ 10 mmol/L)后,MarR可失活。另外,辅助激活蛋白Fis可结合于marRAB基因上游的位点,稳定启动子的局部 DNA结构,促进marRAB启动子的转录激活。

Rob soxS、rob基因的表达产物SoxS、Rob是 MarA的同系物,可取代MarA,结合于marbox,激活marRAB操纵子。marA、soxS、rob3个基因共同构成了marA-soxS-rob调控系统。Fa`brega等^〔27〕新近研究发现,mdtG基因是marAsoxS- rob调控系统中的一部分,其表达产物MdtG过度表达能够导致耐药性增加,mdtG marbox破坏后,MarA、SoxS、Rob的诱导能力均下降。

RamA调节为沙门菌特有,其主要作用是促进acrAB基因的表达。RamA结合位点位于acrAB基因上游,是沙门菌外排泵AcrAB-TolC的主要调节因子。Nikaido等^〔28〕研究表明,在沙门菌胆汁和吲哚诱导的AcrAB机制中,MarA、 SoxS、Rob、AcrR均未发挥作用,而RamA合成增加,促进acrAB的表达。

对细菌外排泵AcrAB-TolC结构和作用机制在国内研究较少,通过借鉴国外研究成果,可为解决耐药问题提供很多帮助。一方面,外排泵基因及其调节基因的定位,其编码蛋白的分离,对新型抗菌药物或外排泵抑制剂的研究提供了重要的靶作用位点;另一方面,通过对外排泵AcrAB-TolC结构和作用机制的研究,为其他外排泵的研究提供了思路和方法。