天门冬(Riadix asparag)为百合科植物天门冬的块根^〔1〕,具有养阴润燥,清肺生津作用^〔2〕。近年来,国内外研究发现天门冬具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤与抗菌作用^〔3〕,但对其抗辐射的研究报道较少。本实验通过建立慢性辐射损伤大鼠模型,观察天门冬水煎剂对辐射损伤肝脏中血清酶、蛋白合成能力及转化生在因子β1(transforming growth factor-beta 1) mRNA表达影响,探讨天门冬水煎剂对慢性辐射损伤肝脏的保护作用及可能机制。

天门冬生药(遵义药材公司),Trizol试剂、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒(大连宝生物公司);引物序列由primer 3设计(上海英俊公司合成);Olympus AU2700全自动生化分析仪(日本Olympus公司);721紫外-可见分光光度计(上海光电研究所);BUCHI旋转蒸发仪(瑞士步琪公司)。天门冬水煎剂制作,临用前沸水煎煮2次,合并滤液,BUCHI旋转蒸发仪浓缩至1 g/mL,置冰箱保存备用。

清洁级SD雄性大鼠120只(第三军医大学动物实验中心),许可证号:SCXK (渝)2007-0005,周龄为8~9周,体重为(120-130) g,将大鼠随机分为6组,每组10只,分别为正常对照组,模型组、阳性对照、低、中、高剂量天门冬干预组。除正常对照组外,其他组大鼠采用瑞典医科达Precise直线加速器产生的6MV-X射线进行全身照射,剂量率为2.6 Gy/min,靶皮距为100 cm,吸收剂量为200 mGy,连续50 d^〔4〕。阳性对照组大鼠背部皮下注射苯甲酸雌二醇100 mg/kg,每周3次,连续7周;低、中、高剂量天门冬干预组大鼠分别灌胃给予2.5、5、10 g/kg天门冬水煎剂,每天1次,连续50 d^〔5〕。

于腹腔动脉取血,离心分离血清,利用全自动生化分析仪进行测定血清总蛋白(total protein,TP),血清白蛋白(albumin,ALB),谷-丙转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT),谷-草转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)。

按照试剂盒说明书测定各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛 (malondialdehyde,MDA)水平。

大鼠肝脏总RNA采用Trizol法提取,RT-PCR进行基因片段扩增并定量。大鼠TGF-β1及内参基因(β-actin)引物如下:TGF-β1上游引物5'-ATACGCCTGAGTGGCTGTCT-3',下游引物为5'- TTGGGACTGATCCCATTGAT-3';β-actin上游引物为5'- GTAGCCATCCAGGCTGTGTT-3',下游引物为5'-ACCCTCATAGATGGGCACAG- 3'。反应条件:(1) RT-PCR:95℃,5 s,59 ℃,20 s,72℃,20 s,40循环。(2)熔解曲线:95℃,5 s,65 ℃,5 s,60循环。PCR反应各管所加模板RNA量约为1 μg,最终通过PCR仪记录的Ct值对起始模板进行定量。

所有数据均以x± s表示,应用SPSS 13.0软件进行统计分析,对各指标进行单因素方差分析,进一步的两两比较应用SNK-q (Student-Newman-Keuls)检验。以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 天冬水煎剂对大鼠血清指标 含量影响(x± s，n = 10)

表 1 天冬水煎剂对大鼠血清指标 含量影响(x ± s，n = 10)

天门冬干预组大鼠血清TP和ALB明显高于模型组,GPT和GOT水平明显低于模型组(F=46.985、15.831、67.102、97.633,P ＜ 0.05),并且呈剂量依赖性;天门冬高剂量组大鼠血清中TP和ALB明显高于阳性对照组,GPT和GOT水平明显低于阳性对照组(F =31.071、68.196、86.150、88.813,P ＜ 0.05)。

表 2

表 2 天门冬水煎剂对大鼠血清中SOD 和 MDA 含量影响(x± s，n = 10)

表 2天门冬水煎剂对大鼠血清中SOD 和 MDA 含量影响(x± s，n = 10)

天门冬干预组大鼠血清中SOD明显高于模型组,MDA水平明显低于模型组(F= 70.551、44.977,P ＜ 0.05),并且呈剂量依赖性;天门冬中、高剂量组大鼠血清中和肝脏组织中SOD明显高于阳性对照组,MDA水平明显低于阳性对照组(F=63.494、185.972,P ＜ 0.05)。

模型组TGF-β1 mRNA相对含量为(210.13 ± 8.15),较正常对照组(35.11 ± 1.08)明显升高,雌激素和天门冬低、中、高剂量均可明显降低 TGF-β1 mRNA表达,其mRNA表达量分别为(48.13 ± 2.85)、 (127.84 ± 6.52)、(71.25 ± 3.74)、(39.25 ± 1.32) (F=499.906,P ＜ 0.05),高剂量天门冬干预组效果优于雌激素(F=13.965,P ＜ 0.05)。

机体受射线照射时,可造成DNA断裂、基因突变、染色体重组^〔6〕。研究报道,天门冬具有提高衰老小鼠脑及血浆SOD含量而降低脑和血浆过氧化脂质代谢物MDA含量作用^〔7〕。本实验结果显示,在长期辐射损伤大鼠模型中天门冬同样具有提高大鼠血清SOD含量而降低血清过氧化脂质代谢物 MDA含量作用。

肝脏是对辐射较为敏感的器官之一,承担着极其重要的生理生化功能,经过慢性辐射大鼠肝功能发生明显改变。 TGF-β1是公认的与纤维化发生最为密切的细胞因子,不仅促进成纤维细胞增殖及分化,促进胶原蛋白等细胞外基质成分基因转录及蛋白合成,通过抑制蛋白酶合成来阻止基质蛋白降解,而且可诱导巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞参与炎性反应^{〔8, 9〕}。本研究结果表明,天门冬水煎剂能明显降低模型组大鼠TGF-β1 mRNA表达,这可能是天门冬对辐射引起的肝功能损伤保护作用机制。