肝癌前病变是指从肝脏炎症出现、肝细胞水肿、细胞结节出现到肝细胞纤维化的演进过程,肝癌前病变过程与肝细胞的异常凋亡密切相关,其中bcl-2和bax是重要的凋亡调控分子,Bcl-2是重要的凋亡抑制蛋白,而活化的bax则促进细胞凋亡^〔1〕。因此,本研究采用腹腔注射二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)建立大鼠肝脏癌前病变模型,动态观察肝脏 bcl-2和bax的表达变化,探讨bcl-2和bax基因在肝癌前病变发生发展中作用,为肝脏疾病诊断和防治提供实验依据。

清洁级SD大鼠(新乡医学院实验动物中心)43只,雌雄不限,体重为(158.0 ± 25.1) g,许可证号:SYXK (豫)2007-0009。

DEN (美国Sigma公司),谷丙转氨酶 (alanine amiotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptadase,γ-GT)、α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase,AFU)、甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein,AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)检测试剂盒(北京利得曼生物有限公司),鼠抗bcl-2、 bax单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),链霉素过氧化物酶 (streptavidin-peroxidase,SP)免疫组化试剂盒(北京中杉生物工程有限公司),Trizol试剂盒、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)试剂(上海生工生物有限公司),bcl-2、bax引物(郑州久是生物工程有限公司),Olympus Au560自动生化分析仪(上海跃进医疗仪器厂)。

随机将大鼠分为对照组(5只)和模型组(38只),对照组腹腔注射生理盐水2.5 mL/kg,模型组大鼠第1 d皮下注射50%的CCl₄ 4 mL/kg,第3 d腹腔注射DEN 50 mg/kg,以后每周注射2次DEN 25 mg/kg,持续12周。于注射后第0、4、7、8、9、11、12周分别取5、7、7、7、7、5只大鼠断颈处死,抽取血清,-70℃超低温冰箱保存;取出肝脏,置于冰盐水中洗涤数次至无血迹,置4%多聚甲醛过夜,石蜡包埋,连续切片,片厚5 μm,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,镜下观察肝脏细胞形态学改变。部分组织液氮速冻,-70℃超低温冰箱保存备用。

采用比色法,自动生化分析仪测定大鼠血清ALT、AST、γ-GT和AFU的活性,AFP、CEA的测定用ELISA法,均严格按试剂盒说明书操作,各反应杯加入大鼠血清及反应液,2 mol/L H₂SO₄终止反应,吸样量为300μL,用自动生化分析仪检测结果,选择波长为492 nm。

按照SP免疫组化试剂盒说明书进行。鼠抗bcl-2单克隆抗体、鼠抗bax单克隆抗体按1:50的比例稀释。阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗,心肌细胞间隙连接蛋白43作阳性对照。以细胞胞浆中有棕黄色颗粒为阳性表达。

肝组织总RNA提取按照Trizol RNA试剂盒说明书进行,用PRIMER 5.0软件设计基因特异性引物,内参扩增片断为528 bp;bcl-2引物5'-ACCGGGAGATCGTGATGAAG- 3';5'-GTTCCACAAAGGCATCCCAG-3',扩增片段560 bp;bax引物5'-GCCCACCAG CTCTGAACAGT-3';5'-GGTCACTGTCTGCCATGTGG- 3',扩增片段486 bp。PCR扩增反应总体积为20 μL。扩增程序为:(变性:94℃ 30 s,退火:55℃ 30 s,延伸:72℃ 60 s)× 32个循环,72℃延伸5 min。采用 Kodak 2.0软件对PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行扫描分析及数据处理。

采用SSPS 10.0统计软件分析,各组实验数据以x± s表示,组间差异的显著性检验用t检验,检验水准 α=0.05。

图 1

注:1. 对照组; 2: 造模7 周; 3: 造模9 周。 图 1 造模后大鼠肝脏组织变化(HE 染色，× 400)

对照组肝组织结构正常,肝细胞排列呈索状,肝血窦排列正常(图 1-1)。给予DEN 4周时,多数肝细胞变性,坏死,空泡样变;7周时,肝细胞肿胀,表现为弥漫性肝细胞水肿,肝小叶基本消失,可见灶性坏死伴炎性细胞浸润,同时出现纤维组织增生及肝细胞再生(图 1-2)。9周时,肝细胞再生和纤维化明显(图 1-3),肝脏表面逐渐粗糙,出现数量不等、大小不一的灰白色近圆形病灶,弥散分布。

表 1

表 1 大鼠血清生化指标含量比较(x± s)

表 1 大鼠血清生化指标含量比较(x± s)

与对照组比较,给予DEN 1~8周和9~12周血清ALT、AST、γ-GT、AFU活性增加(t=12.360、23.543、10.121、15.834,P ＜ 0.01),AFP和 CEA的含量无变化。

图 2

注:1、2、3: 分别为对照组、造模4、12 周bcl-2 蛋白表达; 4、5、6: 分别为对照组、造模4、12 周bax 蛋白表达。 图 2 大鼠肝脏细胞bcl-2、bax 的蛋白表达变化(免疫组化染色，× 400)

表 2

表 2 肝脏组织bcl-2 和bax 表达比较(x± s)

表 2 肝脏组织bcl-2 和bax 表达比较(x± s)

Bcl-2和Bax阳性细胞表现为胞浆呈棕黄色。对照组大鼠肝脏细胞bcl-2表达呈强阳性(图 2-1),DEN组大鼠肝脏细胞 bcl-2表达呈下降趋势(图 2-2、3,表 2)。对照组大鼠有少部分肝脏细胞bax表达(图 2-4),DEN组大鼠可见较多肝脏细胞bax表达阳性(图 2-5、6,表 2),与对照组比较,DEN组大鼠肝脏细胞bax表达明显增强(t=6.892,P ＜ 0.05),bcl-2/ bax比值明显下降(t=5.125,P ＜ 0.05)。

图 3

注:1. 对照组; 2 ～ 7: 分别为DEN 后造模4、7、8、9、11、12 周。 图 3 大鼠肝脏细胞bcl-2 和bax 的mRNA 表达

与对照组比较,DEN组大鼠肝脏组织的bcl-2mRNA表达水平呈下降趋势(t=0.453,P ＞ 0.05),而bax mRNA表达水平呈升高趋势(t=0.236,P ＞ 0.05)。

Bcl-2是一个多基因家族,目前在哺乳动物中,至少发现 15个家族成员,它们形成同源或异源二聚体,调控蛋白酶和核酸酶活性,双向调节细胞凋亡。Bc1-2在线粒体上可直接调节膜上通透性转换孔来调节线粒体膜的通透性,以阻止 Cyto C释放入胞质而抑制细胞凋亡^{〔2, 3〕}。Bax与线粒体膜结合,建立线粒体膜通道,介导线粒体发生释放反应,执行凋亡过程^〔4〕。Bax过度表达时形成bax同源二聚体便诱导凋亡,随bcl-2蛋白表达量上升,竞争结合bax形成更稳定的baxbcl- 2异源二聚体,因此bcl-2与bax之间的比例可能决定了细胞凋亡的敏感性^{〔5, 6〕}。本研究观察到,癌前病变大鼠肝脏细胞中bcl-2表达下降,bax的表达升高,使bcl-2/bax比值减小,与相关文献报道一致^{〔7, 8〕},表明肝脏损伤时bcl-2表达下降、bax表达升高造成线粒体膜通道开放,细胞色素C大量释放到胞质,加速肝脏细胞凋亡,抑制细胞存活,造成肝脏细胞数目减少,从而引起了肝脏功能的恶化。Bcl-2和bax的表达参与肝癌前病变的发生和发展,Bcl-2基因家族在肝脏疾病的发生中起主要作用,Bcl-2和bax可作为辅助指标而应用于肝癌前病变的临床诊断。