中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (11): 1446-1448   PDF    
引用本文
史长华, 路国兵, 李玉红, 许倩, 张卓. 电磁辐射对大鼠海马超微结构及凋亡因子影响[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(11): 1446-1448.
SHI Chang-hua, LU Guo-bing, LI Yu-hong, et al. Effect and its mechanisms of electromagnetic radiation on ultrastructure and apoptosis-related genes in rats’ hippocampus[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(11): 1446-1448.
电磁辐射对大鼠海马超微结构及凋亡因子影响
史长华, 路国兵, 李玉红 , 许倩, 张卓    
承德医学院病理教研室, 河北 承德 067000
收稿日期: 2011-01-30.
基金项目: 河北省自然科学基金(C2007000921);河北省卫生厅资助项目(20100136)
作者简介: 史长华(1983- ),女,河北人,助教,硕士,主要从事病理学研究工作.
通讯作者: 李玉红,E-mail:youngcheer2003@yahoo.com.cn
摘要: 目的 探讨2 000μW/cm2电磁辐射对大鼠海马神经元超微结构及凋亡相关因子表达影响.方法 实验分空白对照组,假辐射组,1、2、3 h/d辐射组,采用2 000μW/cm2微波对大鼠头部 进行辐射,透射电镜观察海马超微结构改变,免疫组织化学法检测海马组织Bcl-2、Bax表达,蛋白免疫印迹(western-blot)法检测海马组织Caspase-3表达.结果 辐射组神经元细胞核仁消失,染色质凝集,核内出现透明区等早期凋亡征象,突触界面结构改变;1、2、3 h/d辐射组Bax表达分别为(0.059 8±0.005 1)、(0.066 3±0.006 1)、(0.086 9±0.007 3),Caspase-3表达分别为(0.56±0.04)、(0.74±0.05)、(0.94±0.03),高于对照组(P<0.05);1、2、3 h/d辐射组Bcl-2表达分别为(0.056 9±0.0087)、(0.052 4±0.007 8)、(0.042 3±0.001 4),低于对照组(P<0.05).结论 电磁辐射可引起海马神经元细胞损伤和凋亡,其机制与凋亡相关因子Bc1-2、Bax、Caspase-3表达改变有关.
关键词: 电磁辐射     学习记忆     海马     超微结构     凋亡相关基因    
Effect and its mechanisms of electromagnetic radiation on ultrastructure and apoptosis-related genes in rats’ hippocampus
SHI Chang-hua, LU Guo-bing, LI Yu-hong ,et al    
Department of Pathology, Chengde Medical College Chengde 067000, China
Abstract: Objective To evaluate the effects of 2000 μW/cm2 electromagnetic radiation on hippocampus ultrastructure and apoptosis-related genes.Methods Totally 100 Wistar rats were randomly divided into normal control,sham-radiated,and 1,2 and 3 hours/per day radiation groups.The rats in the radiation groups were exposed to microwave of 2000 μW/cm2 on their heads and then the morphological changes in the hippocampal neurons were detected by transmission electronic microscopy and the expressions of Bcl-2 and Bax protein were detected by immnunohistochemistry and the expression of caspase-3 by western-blot.Results Microscopic observation revealed that the chromatin coacervation and chromatin of hippocampal neurons gathered along the inside of the nuclear membrane in radiation group.The structure of synaptic interface changed.Compared with the normal control group,the expression of Bax and caspase-3 protein increased and Bcl-2 protein decreased in radiation group.Conclusion The electromagnetic radiation exposure of 2 000 μW/cm2 can induce the abnormality of neuronal apoptosis in rat hippocampus.The machanism of hippocampus neuron injury involves in the expression of apoptosis related genes,such as Bc1-2,Bax,and caspase-3.
Key words: electromagnetic radiation     learning memory     hippocampus     ultrastructure     apoptosis-related gene    

随着对细胞凋亡的深入研究发现,阿尔茨海默病和铅中毒等一系列与中枢学习和记忆有关的疾病发生与神经细胞凋亡有关〔1, 2〕。目前由于电子技术应用和通讯工业发展,电磁辐射污染越来越严重,电磁辐射过量接触可导致中枢神经系统和植物神经功能紊乱,且动物实验和流行病学调查均表明,电磁辐射可以引起学习记忆及认知能力障碍〔3, 4〕。电磁辐射可造成实验大鼠学习记忆能力明显下降〔5〕。为进一步阐明电磁辐射引起的中枢神经损伤机制,本实验采用900 MHz连续脉冲信号源模拟移动电话信号,以2000 μW/cm2的功率密度对大鼠进行近场辐射,建立大鼠电磁辐射模型,应用超微结构观察、免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western-Blot)法检测电磁辐射后大鼠海马神经元凋亡和凋亡相关蛋白表达特征,探讨电磁辐射对神经元的损伤机制。

1 材料与方法 1.1试剂与仪器

兔抗鼠Bcl-2、Bax和caspase-3多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);羊抗兔IgG二抗(美国KPL公司);免疫组化试剂盒(美国Invitrogen公司)。HP8657B高频信号发生器(美国HP公司);EMR-300场强仪(北京大西洋公司);EMUC6超薄切片机(德国莱卡公司);H-7650B透射电镜(日本日立公司)。

1.2 实验动物分组与处理

清洁级健康Wistar大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)100只,体重(270 ± 10) g,合格证号:SCXK (京)2009-0003。随机分为5组,分别为电磁辐射组(1、2、3 h/d)、假辐射组和空白对照组,每组20只。将高频信号发生器设定成发射频率为900 MHz的连续脉冲信号(模拟移动电话信号),通过场强仪检测调节辐射点的功率密度为2 000 μW/cm2。分别将实验大鼠装入自制暴露鼠笼,固定体位,头部接受连续微波辐射。每天将辐射组大鼠分别暴露1、2、3 h,连续暴露30 d;假辐射组微波辐射功率密度为0 μW/cm2;空白对照组大鼠未进行任何处理。

1.3 实验方法 1.3.1 海马超微结构变化及突触超微结构定量分析

0.1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,用生理盐水约200 mL,再以2%多聚甲醛-2.5%戊二醛心脏灌流。断头取脑,迅速剥离海马,解剖镜定位,取海马CA1区组织1.0 mm3于2.5%戊二醛溶液中,按常规方法制备超薄切片,透射电镜观察并选取GrayⅠ兴奋型突触摄片。各组随机选取40~50张电镜图片参照 Bertoni等方法〔6, 7〕,采用MIAS4.0病理图像扫描分析系统对突触界面结构(即突触界面曲率、突触活性带长度和突触间隙宽度)进行定量分析。

1.3.2 Bcl-2、Bax免疫组化染色观察

取视交叉后4 mm与小脑前之间的海马组织连续冠状切片,片厚4 μm,一抗选用兔抗Bcl-2、Bax多克隆抗体,二抗选用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,依据试剂盒说明操作,以磷酸缓冲盐溶液代替一抗作为阴性对照。Bcl-2、Bax以神经细胞胞浆及胞膜上呈现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性反应。应用Med 6.0软件进行图像分析处理,测定阳性反应物灰度值。从每组随机抽取3只大鼠的免疫组化切片,在海马CA1区各选取3个测量点 (像素量基本一致),首先测定各点颗粒细胞层灰度值,再用该测量值减去相应的背景灰度值后求平均值。

1.3.3 海马组织caspase-3蛋白表达水平检测

0.1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,迅速断头取脑,在低温修块台上分离出双侧海马组织,置于Eppendorf管中。称取海马组织,提取总蛋白进行浓度测定,一抗选用兔抗caspase-3多克隆抗体,二抗选用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,β-actin作为内参,应用蛋白免疫印迹法(western-blot)方法检测各组大鼠海马组织 caspase-3蛋白表达水平。蛋白上样量40 μg,10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺电泳,转膜,封闭,抗体孵育(一抗终浓度2 μg/mL),采用化学发光法显色,暗室X光胶片曝光,采用Alpha Innotech软件分析照片中蛋白条带灰度值,计算各待测条带与其相应内参β-actin的灰度值比值。

1.4 统计分析

采用SPSS 12.0软件对实验结果进行统计处理,组间比较用采用方差分析,两两比较用最小显著差异t检验,数据以x± s表示,P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 电磁辐射对海马CA1区超微结构影响(表 1)
表 1 各组大鼠海马CA1 区突触界面结构变化(x± s，n = 6)

电镜观察显示空白对照组和假辐射组海马CA1区神经元细胞核形态规则,染色质均匀,突触前、后膜和突触间隙清晰,突触前成分中可见排列紧密且数量较多的圆形突触小泡(图 1A);辐射组线粒体膜间隔性断裂,基质变性;突触前膜轮廓模糊,突触小泡融合成片状,突触间隙内电子密度增加(图 1B);部分海马神经元细胞固缩,外形较不规则,胞浆密度加深;核内异染色质增多,凝集成团块状或新月体状并边集于核膜下,似有早期凋亡征象。与空白对照组比较,各辐射组突触活性带长度缩短(F=3.10,P ＜ 0.05),突触间隙增宽(F=2.89,P ＜ 0.05),突触界面曲率减小(F=3.07,P ＜ 0.05);而假辐射组与空白对照组之间无明显差异(F=1.21,P ＞ 0.05)。

注:A: 空白对照组线粒体与突触结构清晰，
B: 辐射组线粒体膜断裂、突触结构模糊。 图 1 海马CA1 区线粒体与突触超微结构观察( × 50 000)
2.2 电磁辐射对大鼠海马CA1区Bcl-2、Bax受体表达影响 (表 2)
表 2 各组大鼠海马CA1 区Bcl-2、Bax 蛋白表达(x± s，n = 6)

光镜下观察空白对照组和假辐射组海马CA1区神经元层次清楚,胞体呈圆形或椭圆形,排列紧密,Bcl-2、Bax阳性结构主要分布在胞膜和突起,呈棕黄色;而辐射组阳性神经元数目明显减少,排列松散,染色较淡;其中,3 h/d辐射组大鼠海马CA1区可见大量凝固性坏死细胞,细胞排列较为紊乱。与空白对照组比较,辐射组大鼠海马CA1区Bax蛋白表达升高(F=2.87,P ＜ 0.05),Bcl-2蛋白表达水平与Bcl-2/Bax比值均降低(F=2.96,P ＜ 0.05)。假辐射组与空白对照组比较差异无统计学意义(F=1.48,P > 0.05)。

2.3 电磁辐射对大鼠海马组织caspase-3蛋白表达影响(图 2)
注:1. 空白对照组，2 . 假辐射组; 3 ～ 5: 1、2 、3h /d 辐射组。 图 2 各组大鼠海马CA1 区caspase-3 蛋白表达(western-blot 法)

1、2、3 h/d辐射组大鼠海马caspase-3蛋白表达水平分别为(0.56 ± 0.04)、(0.74 ± 0.05)、(0.94 ± 0.03),与空白对照组(0.22 ± 0.01)比较,均明显升高(F=9.21,P ＜ 0.01)。假辐射组大鼠海马caspase-3蛋白表达与空白对照组之间无明显差异(F=1.16,P ＞ 0.05)。

3 讨 论

一般认为,海马CA1区神经元损伤是学习记忆障碍的病理基础。而突触可塑性又被认为是中枢神经系统学习、记忆的神经生物学基础,其变化与宏观上学习记忆的变化相一致〔8〕。海马细胞损伤或凋亡可进一步影响海马神经元细微形态结构及突触的建立,从而损害动物学习记忆能力。Bcl-2和Bax与凋亡的调控关系非常密切。通常Bcl-2和Bax的比值决定了细胞凋亡的发生与否,Bc1-2/Bax比值升高则抑制细胞凋亡;Bc1-2/Bax降低则促进细胞凋亡〔9〕。Caspase-3是目前研究最多、最关键的一种细胞凋亡执行分子。活性 caspase-3可直接水解细胞重要结构及功能蛋白,导致蛋白酶级联反应放大效应,最终导致细胞凋亡〔10〕。本研究结果显示,2000 μW/cm2电磁辐射后大鼠海马细胞发生凋亡等损伤效应,且随着电磁辐射时间增加,Bax、caspase-3表达明显升高,Bc1-2表达及Bc1-2/Bax比值明显降低。提示Bc1-2、 Bax、caspase-3可能在电磁辐射引起大鼠海马神经元细胞凋亡异常过程中起到了调控作用,从而影响大鼠学习记忆功能。

参考文献
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