衰老已成为威胁人类健康的首要问题。截止2006年,全球≥65岁的老年人达5亿。肾脏是衰老较快的器官。肾脏衰老的组织学特征为肾动脉硬化,肾小球弥漫硬化,肾皮质减少,肾小管萎缩,间质纤维化。衰老的肾脏即使无形态学改变也会出现衰老相关性β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)和 P16INK4a^〔1〕表达增加。细胞衰老与上皮细胞转分化(epithelial- mesenchymal transition,EMT)是肾脏功能减退过程中的2个过程,彼此有着密切的联系。EMT的转录因子Twist和 Zeb1可通过抑制衰老和增强EMT而加重肿瘤的局部扩散和远处转移。限食和二甲双胍可通过多途径、多靶点延缓衰老并预防衰老相关性疾病及抑制EMT。本文对衰老和EMT的关系及限食和二甲双胍对二者的作用作一综述。

衰老是自我调节能力及机体稳态受损,使个体对环境及内在压力的敏感性增强,进而使发病率和死亡率增加,衰老是一个程序化的生物学过程,通过基因信号的开关对保持自身稳态与自我防护的神经、内分泌、免疫系统进行调控^{〔1, 2〕}。基因图谱分析显示,青年与老年仅有小部分基因存在微小差异。氧自由基,纤维化调节因子,线粒体损伤,端粒的缩短,抗凋亡和抗死亡过程中细胞修复与增殖的不平衡等均可导致衰老及衰老相关的器官功能的下降^〔2〕。

细胞衰老的特征为:在充足的营养和有丝分裂原存在的条件下细胞失去增殖能力,但却保持生存能力和代谢活性^〔3〕。在人类,这一过程伴随端粒酶活性丧失导致的染色体末端DNA重复序列和端粒的减小。细胞的衰老还可由一些不依赖于细胞增殖分化的各种生理压力诱导,称为压力诱导型早衰(stress-induced premature,SIPS)^〔4〕,致癌基因诱导的衰老(oncogene-induced semescence,OIS)也属于此范畴。SIPS通过p16/Rb或ARF/p53途径激活,从而使细胞周期停滞。氧化应激、DNA损伤、Ras激活、营养缺乏等均可导致SIPS。

某些环境因素及内在生理压力的变化在引起SIPS的同时,也诱发并加重了EMT的发生。EMT是在各种损伤作用下已分化的上皮细胞经历的一个细胞转型的过程,最后形成能产生细胞外基质的成纤维细胞和纤维母细胞。EMT不仅存在于肾小管上皮细胞,还存在于血管内皮细胞及足细胞,参与肾间质纤维化,及足细胞功能下降、蛋白尿、肾小球硬化等病理过程^〔5〕。

上皮是由极化的上皮细胞组成。极化的上皮细胞通过粘附连接紧密的排列在一起。这些粘附连接是由钙粘蛋白(Ecadherin) 、α-、β-和γ-连环蛋白(catenin)组成,并与肌动蛋白的细胞骨架相连,因此为细胞提供了一个稳定的结构。在 EMT过程中,间充质蛋白如波形蛋白(vimentin)、纤维蛋白 (fibronectin)和平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin)的表达均可上调^〔6〕。EMT的共同特征是E-cadherin的下调。E-cadherin可被碱性螺旋环螺旋(basic helix-loop-helix)转录因子和锌指转录因子抑制。碱性螺旋环螺旋转录因子包括E12/ E47,Twist1(Twist)和Twist2(Dermo1)。锌指转录因子包括 Snail家族(Snail或Snail和Sulg或Snai2)和Zeb家族,Zeb家族由Zeb1和Zeb2(SIP1)组成^{〔7, 8, 9〕}。E-cadherin是由CDH1编码的,这些转录因子通过抑制CDH1的转录进而抑制E-cadherin的合成,促进EMT。

在高糖、蛋白超负荷、低氧、氧化反应等环境刺激和持续感染、自身免疫反应、化学物质等的作用下,肾小管上皮细胞会产生多种趋化因子和细胞因子。趋化因子在肾小管和毛细血管袢周围形成一个浓度梯度,使单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞(尤其是T淋巴细胞)等炎细胞直接流向小管间质。这些细胞反过来促进促炎因子、促纤维化因子和MMPs的产生^〔10〕。细胞因子所构成的微环境并不适合肾小管上皮细胞和内皮细胞的生存,为了逃避凋亡它们被迫转型,即由内皮细胞向成纤维细胞转化。因此,EMT是肾小管上皮细胞在经历慢性压力/损伤后的适应性反应。

细胞衰老与EMT是肾脏功能减退过程中的2个过程,彼此独立又相互关联,相互影响。衰老细胞虽不能发生EMT但分泌TGF-β、EGF、IGF-1、血管内皮生长因子增多,使上皮细胞和内皮细胞所处的微环境发生转变。其中TGF-β在EMT中起关键作用。在TGF-β的激活下,穿膜的TGF-βⅡ型受体和 Ⅰ型受体紧密连接形成复合体,使Smad2和Smad3磷酸化后被激活。磷酸化的Smads与Smad4结合后转入细胞核,通过与特异的顺式作用元件结合,控制TGF-β介导的基因转录^〔11〕。更重要的是,与EMT相关的各种基因均是TGF-β/ Smad信号通路作用的靶点。目前,衰老与MET的关系在肿瘤领域备受关注。肿瘤的病因复杂多样,但最终均表现为病灶的远处转移和死亡。局部扩散是恶性肿瘤发展的第一步,EMT在这一过程中起关键作用。在胚胎发育过程中,EMT使上皮细胞之间失去联系,从而使细胞获得了流动性,移动到邻近部位或远处,最终使胚胎发育成形。在癌症的发展过程中,上皮细胞的癌细胞激活休眠状态的EMT,使癌细胞获得间充质细胞特性,从局部扩散发展到远处转移,而且EMT还使癌细胞对化疗的敏感性降低^〔12〕。在肿瘤发生发展的过程中,OIS通过激活Rb和p53等抑制癌基因使细胞周期停滞^〔13〕。此外,OIS还增加了SA-β-GAL的活性,核染色质的重构和 DNA的损伤^〔14〕。虽然OIS仅在体外实验中被观察到,但一直被认为是哺乳动物细胞抑制肿瘤生长的重要特性^〔15〕。

EMT的转录因子Twist与衰老及细胞周期之间的关系早在10年前就引起了研究者的关注。在T47D人类乳腺癌细胞的研究中发现,敲除Twist1基因可使SA-β-gal增加,同时细胞周期中处于停滞状态的细胞数也明显增加。进一步研究证明,这一过程是Twist通过抑制Arf基因并逆转p53诱导的细胞周期停滞实现的,而Arf基因在衰老的细胞中呈高表达^{〔16, 17〕}。Ansieau等^〔18〕研究显示,Twist不仅可影响 p16INK4a和p21CIP1的转录,还可下调p53和Rb。

Zeb1与衰老及细胞周期之间的关系与Twist类似。Zeb1缺陷大鼠胚胎成纤维细胞细胞周期抑制蛋白p21CIP1增多^〔19〕,表明Zeb1抑制了p21CIP1的表达。Zeb1通过直接与 CDKN1A和INK4b的激活剂结合使衰老的激活途径受阻,同时Zeb1也对p53和Rb信号通路产生影响,进而抑制衰老。敲除Zeb1的小鼠胚胎成纤维细胞呈现MET (恰好与EMT相反)过程,表现为E-cadherin的增加和间充质蛋白的减少^〔20〕。

Twist和Zeb1在肿瘤的发生发展中产生了双层负面效应:抑制细胞衰老,促进EMT的发生,最终导致了肿瘤的生长、扩散和转移。这不仅阐述了癌症进展的2个重要机制,还为癌症的治疗提供了新的靶点。

随着医学水平的飞速发展,延缓衰老和预防衰老相关性疾病已成为医学科学研究的一大热点。研究者渴望寻找一种既能延缓衰老又能抑制EMT的方式。

研究发展,CR能延长多物种的平均寿命和最长寿命(即使在晚年),且能延缓衰老相关性改变的发生^〔21〕。线粒体能量代谢的调节功能下降可作为疾病和衰老的标志。在人类、小鼠、果蝇和蠕虫的比较中发现,线粒体电子传递体(ETS)核编码基因的下调是4种生物共同存在的衰老影响因素。CR可通过保护ETS核编码基因的转录和线粒体的活化,从而抑制年龄相关的线粒体功能^〔22〕。随着年龄的增长小鼠骨骼肌线粒体数量明显增加,呼吸系统损害加重。 UCP2和UCP3解偶联蛋白可显著减少ROS的产生,CR可使动物体内UCP3增加^〔23〕。小鼠的衰老伴随p53介导的转录的增加,而p53活性的增加可被CR抑制^〔23〕。胰岛素抵抗是公认的衰老表现,胰岛素、葡萄糖和氨基酸等因子均会激活 TOR信号通路,当TOR信号通路被激活后,通过S6K使胰岛素受体(IRS1/2)减少,引起胰岛素抵抗。CR可增加糖耐量并提高胰岛素的敏感性^〔24〕,使mTOR (哺乳动物体内参与细胞增殖和肿瘤增长的一个蛋白酶)的活性下降^〔25〕,并能通过 insulin/IGF-1信号通路使DAF-16下调,进而延长寿命。

衰老的胸腺成纤维细胞特异蛋白 -1(FSP-1)/S100A4,vimentin表达增多,CR能明显抑制衰老胸腺成纤维细胞的产生,使FSP-1/S100A4,vimentin的表达减少^〔26〕。用骨髓嵌合体和转基因的方式作用于小鼠,发现肾间质的成纤维细胞有2个来源,FSP1阳性的成纤维细胞一小部分来自于骨髓,大多数来自原位的EMT^〔27〕,因此,FSP1的表达可以反映EMT的程度。据此,认为CR能抑制EMT。

尽管CR被它的研究者大作宣传,但是老年病学家相信面对美食没有人愿意节食。所以研究者把目标转向了模拟限食(calorie restriction mimetics,CRM),即使用药物代理消耗食物和水,不用限制能量的摄入,最终在延长寿命及减少衰老相关性疾病方面达到同限食一样的作用^〔28〕。其中二甲双胍是 CRM的一个代表药物。

双胍类是双胍复合物的派生物,主要有丁双胍、二甲双胍和苯乙双胍,能提高血糖的稳定性,并对衰老有干预作用。苯乙双胍和丁双胍因其能致乳酸性酸中毒已逐渐被临床淘汰。二甲双胍仍被认为是治疗2型糖尿病的一线药物。二甲双胍的主要作用有以下几方面:抑制肝糖原的分解,增加胰岛素的敏感性;作为AMPK的潜在激活物,能抑制mTOR^〔29〕,二甲双胍还能延长乳腺癌易感大鼠的寿命,抑制糖尿病大鼠的动脉粥样硬化,延长啮类动物的寿命^〔30〕。

研究表明,二甲双胍可抑制 MCF-7乳腺癌中TGFβ介导的上皮细胞标志物E-cadherin的减少及马-达二氏犬肾(MDCK)间充质细胞标志物vimentin的积聚^〔30〕。二甲双胍可削弱纤维化,(如慢性肾脏疾病、非酒精性脂肪肝、心衰或硬化症)和恶性进展(很有可能是通过抑制TGFβ调节的炎症和免疫反应-炎症-衰老)病理过程中 TGFβ诱导的间充质细胞特性,其分子机制仍表现为一个抗衰老的过程^〔31〕。二甲双胍可下调EMT的促进物,包括转录因子Zeb1,Twist1和Snai2(SLug),从而调节乳腺癌干细胞的发育^〔32〕。

细胞衰老与EMT是参与肾功能减退的2个过程,彼此独立又相互关联。抑制EMT的转录因子Twist和Zeb1有望抑制肿瘤的局部扩散和远处转移。限食和二甲双胍可延缓衰老并预防衰老相关性疾病及削弱EMT,有望成为延缓肾脏衰老的有效手段,但还需要进一步验证。