铝是常用的金属材料,人体可通过职业环境、使用铝制炊具和餐具、含铝食品添加剂和某些含铝药物摄入,过量摄入会引起红系造血系统及其他系统的损害^〔1〕。研究表明,经口接触铝可以引起实验大鼠和小鼠血液系统的损害,对造血过程产生影响^〔2〕。然而,对于铝离子造血毒性的机制目前尚有许多方面并不明确。人髓系白血病细胞K562细胞在一些诱导剂作用下可向红系和巨核系等方向分化,具有造血祖细胞的特点,是目前研究细胞增殖分化机制的常用模型^{〔3, 4, 5〕}。为建立铝等金属离子红系血液毒性机制体外研究模型,本实验观察了铝离子在无明显细胞毒性的浓度范围内对K562细胞红系分化的影响。

(1) K562细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心);(2)试剂:RPMI 1640培养基(美国Invitrogen公司);胎牛血清(美国HyClone公司);氯化铝(AlCl3 ,北京奥利化学品公司);氯化高铁血红素(美国Sigma公司);异硫氰酸荧光素(FITC)-IgG和FITC-anti-human CD71(美国Invitrogen公司)。

K562细胞在10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中37℃、5% CO₂培养箱中培养。

将对数生长期K562细胞以3.5 × 10⁵个/mL密度接种于24孔板中培养12 h后,每孔分别加入50、100、150 μmol/L铝离子(AlCl₃ ),每个浓度组4个平行;同时以配制铝离子的溶剂磷酸盐缓冲液作为溶剂对照组。分别于24、48和72 h之后取出100 μL细胞,加入台盼蓝染液染色5 min,普通倒置光学显微镜下以红血球记数板计数活细胞和蓝染的死细胞数量,每个样取3次记数,计算出每组的细胞死亡率和各浓度组细胞相对于溶剂对照组的相对活力,其中:细胞死亡率(%)=100 ×死细胞数量/(活细胞数量+死细胞数量);相对活力(%)=100 ×各浓度组活细胞密度/溶剂对照组活细胞密度。

选用指数生长期的 K562细胞,以1 × 10⁵个/mL的细胞浓度接种于24孔培养板中,在37℃,5% CO²培养箱中培养12 h后,实验组分别加入终浓度为0、50、100、150 μmol/L铝离子,同时加入40 μmol/L氯化高铁血红素,然后重新置于培养箱中避光培养;48 h后收集细胞,用磷酸盐缓冲液洗2次,制备成细胞悬液,加入1/5体积的联苯胺-H₂O₂显色液(含质量体积分数为0.2%联苯胺、0.5 mmol/L冰乙酸,临用时加入50 mmol/L H₂O₂ ),显色 10 min,染色后细胞用血细胞计数板在光学显微镜下计数500个细胞中Hb阳性(蓝染)细胞数,计算Hb阳性细胞比例,反应氯化高铁血红素诱导K562细胞红系分化情况。

将对数生长期K562细胞以2 × 10⁵个/mL的浓度接种于24孔板中培养12 h后,加入100 μmol/L铝离子处理48 h,离心收集细胞。用PBS-B (含1%牛血清白蛋白,4 ℃放置预冷)洗1次,再加入磷酸盐缓冲液-B重悬沉淀,然后加入FITC标记的 CD71抗体5μL,混匀,避光4℃孵育30 min;离心细胞,用磷酸盐缓冲液洗2次;采用流式细胞仪检测K562细胞表面转铁蛋白受体CD71蛋白表达。根据几何平均荧光强度计算经铝离子处理的细胞相对荧光强度(RFI),RFI=金属离子处理样品几何荧光强度/对照样品几何荧光强度。

使用SPSS 13.0进行统计分析,数据以x ± s表示,P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

表 1

表 1 不同浓度AlCl3 处理不同时间后K562 细胞 相对活力和死亡率(n = 4，%)

表 1 不同浓度AlCl3 处理不同时间后K562 细胞 相对活力和死亡率(n = 4，%)

结果可见,经铝处理K562细胞的活细胞数量出现浓度依赖性降低,但死亡细胞比例与对照组比较,差异无统计学意义。显微镜下直接观察显示,视野内经铝处理后各组K562细胞数量明显少于对照组细胞,而形态无明显变化,表明铝离子对K562细胞生长有较为明显的抑制作用,但无直接导致细胞死亡的细胞毒性。

表 2

表 2 铝离子处理48h 抑制氯化高铁血红素诱导的K562 细胞红系分化(n = 4)

表 2 铝离子处理48h 抑制氯化高铁血红素诱导的K562 细胞红系分化(n = 4)

结果显示,铝离子对氯化高铁血红素诱导的K562细胞红系分化也有较明显的浓度依赖抑制作用。

图 1

注:同型对照抗体表示非特异结合。 图 1 经铝离子处理后K562 细胞表面CD71 蛋白表达变化

应用免疫荧光标记抗体结合流式细胞术分析K562细胞经铝离子处理后细胞表面转铁蛋白受体(CD71)表达水平。结果显示,经100 μmol/L铝离子处理48 h后的K562细胞表面CD71的表达水平增加27.7%。

本试验结果显示,在铝离子50~150μmol/L浓度范围内,浓度依赖性的抑制细胞活性,但不引起细胞明显死亡,表明在所用浓度范围内,细胞数量的明显减少并非铝离子的直接细胞毒作用,可能是抑制了细胞的增殖过程。在这个没有明显直接细胞毒性的浓度范围内,进一步观察AlCl3处理对K562细胞诱导红系分化能力的影响,结果显示,铝能浓度依赖性抑制氯化高铁血红素诱导的K562细胞红系分化。Pérez等研究表明,100μmol/L柠檬酸铝处理72 h同时加入氯化高铁血红素诱导分化时,K562细胞的红系分化率从对照细胞的80%降到65%^〔6〕。铝无论是在体外骨髓细胞培养还是整体动物实验均可引起骨髓红系祖细胞红系克隆形成单位CFU-E的抑制^〔7〕。而且,铝具有抑制δ-氨基-γ-酮戊酸脱水酶活性的作用,进而抑制血红素合成^〔8〕。这些研究表明,铝可干扰红细胞的分化和发育过程。

由于铁和铝均属于金属离子,铝可能会干扰铁离子的转运过程,而铁是合成血红素重要成份,因而也会影响血红素的合成。有研究就显示,体内铝的运输是通过转铁蛋白运输的,从而占领转铁蛋白的铁结合位点,而降低转铁蛋白的饱和比例^{〔9, 10〕}。经100μmol/L AlCl₃处理K562细胞48 h后,细胞表面CD71表达有一定程度增加,提示由于非Fe金属离子存在,可能会竞争性的造成细胞内Fe水平降低,进而通过CD71基因非编码区的铁反应元件来调节CD71的表达。不过,Pérez的研究显示,用柠檬酸铝处理K562细胞并未观察到 CD71转录水平和蛋白表达水平的表达^〔11〕。

本试验结果提示,铝在没有表现出明显直接细胞毒性的浓度下,可以抑制氯化高铁血红素诱导的K562细胞红系分化,然而有关机制还有待进一步研究,而K562细胞可用于这方面的机制研究。