草苁蓉(Boschniakia rossica Fedtsch.et Flerov)为列当科多年生草本植物,寄生于桤木属(Alnus)植物的细根上,为国家三级重点保护植物。草苁蓉具有补肾壮阳、润肠止血等功效,民间常将其作为抗衰老药使用,故有不老草之称。近年来,国内外学者对草苁蓉的化学成分进行研究发现,草苁蓉中含草苁蓉内酯、草苁蓉醛、草苁蓉酸、草苁蓉碱和生物碱等多种活性成分^{〔1, 2〕}。草苁蓉多糖(Boschniakia rossica polysaccharides,BRPS)是从草苁蓉中提取出来的另一种活性成分,其含量在全株平均可达20%。由于草苁蓉分布的局限性,其药理作用的研究较少。本研究主要探讨草苁蓉多糖的抗红细胞脂质过氧化和红细胞保护作用,为草苁蓉的开发提供实验依据。

丙二醛(malonyldialdehide,MDA)、蛋白质检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),其余试剂均为国产分析纯。HITACHI himac cp 100α超速离心机(日本日立公司),U-2010型紫外分光光度仪(日本岛津公司)。

家兔(延边大学医学部动物科,合格证号: SCXK (吉)2007-0004)12只,4月龄,体重2.0~2.5 kg,雌雄不限。

草苁蓉采自吉林省长白山。草苁蓉多糖用常规方法提取,用Sevag方法分离除去多糖中的蛋白质。酸水解后用薄层层析鉴定,结合氕核磁共振确定多糖成分^〔2〕。精确称取一定量BRPS溶于生理盐水中,配成浓度为5 mg/mL的BRPS溶液。根据测定需要,将其稀释不同倍数使用。

于 1 mL 0.031 3、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 mg/mL BRPS中,分别加入9 mmol/L FeSO₄和9 mmol/L水杨酸-乙醇各1 mL,再加入8.8 mmol/L H₂O₂ 1 mL启动Fenton反应,摇匀后37℃反应0.5 h。3 000 r/min离心10 min,测定吸光度(A₅₁₀ )值。对照组加入双蒸水1 mL,每组分别做一个本底吸收管。清除率(%)=[Ao-(Ax-Axo)]/Ao × 100%;其中 Ao为对照组吸光度,Ax为BRPS组吸光度,Axo为本底吸收值。

每次随机选取6只家兔,乙醚麻醉后,经颈动脉取血,肝素抗凝,离心分离红细胞。将红细胞用冷生理盐水洗3次,制成0.5%红细胞悬浮液。另取新鲜红细胞,以生理盐水洗3次,放入35倍体积的低渗磷酸缓冲液,4 ℃过夜溶血。溶血完全后20 000 g、4℃离心 40 min,收集沉淀。洗涤4次(4℃、20 000 g离心40 min)后可得白色絮状的红细胞膜。用PBS缓冲液稀释成蛋白浓度为1 g/L的纯化红细胞膜悬浮液,4 ℃保存以备用。

取1 mL红细胞或红细胞膜悬浮液,加入0.01、0.05、0.5和5 mg/mL BRPS 0.1 mL,模型组在1 mL红细胞或红细胞膜悬浮液中分别加0.1 mL生理盐水或磷酸盐缓冲液,于37℃水浴10 min。再加入0.1 mL 60 mmol/L H₂O₂和0.1 mL 6 mmol/L FeSO₄诱导产生羟自由基。继续在37℃温浴2 h后,加入15%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)1 mL终止反应。按硫代巴比妥酸法测定MDA生成量并计算抑制率。MDA抑制率(%)=(A_模型 -ABRPS )/(A_模型-A_空白)× 100%。

取0.5%红细胞悬液1 mL,加入0.062 5、0.125、0.25、0.5和1 mg/mL BRPS 0.1 mL,模型组则在1 mL红细胞悬浮液中加0.1 mL生理盐水,于37℃水浴10 min。加入60 mmol/L H₂O₂ 0.1 mL启动反应,37℃温浴1 h后,加生理盐水稀释3倍,1 000 g离心10 min,测定上清液415 nm处吸光度(A₄₁₅ )值。以空白对照组为100%溶血,计算溶血度和抑制率。溶血度(%)= A_BRPS/A_模型× 100%;抑制率(%)=(A_模型-A_BRPS )/(A_模型- A_空白)× 100%。

数据以x ± s表示,用SPSS 11.0统计软件进行方差分析,以Turkey's多因素t检验进行多组数据间比较,P ＜ 0.01差异有统计学意义。

图 1

图 1 BRPS 对羟自由基清除能力

·OH是活性氧中活性最高且造成损伤最大的一种。BRPS对·OH具有较好的清除作用,浓度小于0.25 mg/mL时,回归方程为y= 170.8x+9.564 5,R²=0.993;呈明显浓度依赖性,其对·OH的半数清除浓度为0.24 mg/mL。

表 1

表 1 BRPS 对·OH 诱导的红细胞及红细胞膜脂质 过氧化影响(x± s，n = 6)

表 1 BRPS 对·OH 诱导的红细胞及红细胞膜脂质 过氧化影响(x± s，n = 6)

BRPS对·OH诱导的红细胞及纯化红细胞膜脂质过氧化作用具有明显抑制作用,其抑制作用呈良好的量效关系。根据回归方程测得,BRPS对·OH诱导的红细胞及纯化红细胞膜体系脂质过氧化作用的半数抑制浓度IC₅₀分别为0.047和0.112 mg/mL。

表 2

表 2 BRPS 对H2O2 诱导的红细胞氧化溶血影响(x± s，n =6)

表 2 BRPS 对H2O2 诱导的红细胞氧化溶血影响(x± s，n =6)

红细胞经 H₂O₂诱发后,模型组吸光值增加,说明H₂O₂可以氧化红细胞膜,引起红细胞溶血。BRPS组溶血度明显低于模型组,表明BRPS可抑制红细胞的氧化损伤,保护红细胞膜,且溶血度随BRPS浓度的增高而降低,呈一定量效关系,其对·OH诱导的红细胞溶血的半数抑制浓度分别为0.068 mg/mL。

众所周知,自由基损伤参与多种疾病的病理生理过程,如炎症、免疫失调、动脉粥样硬化、恶性肿瘤、衰老等^〔4〕。因此,研究和开发抗氧化剂和自由基清除剂对疾病的防治有重大意义。由于红细胞处于一个充足的氧环境中,又含有血红蛋白和丰富的不饱和脂肪酸膜,因而最早被作为自由基研究的模型。而红细胞脂质代谢的改变,将直接影响其结构和功能。如自由基生成过多或保护不足时,红细胞膜中磷脂发生过氧化,膜通透性发生改变,使红细胞多种功能受到损害。MDA是脂质过氧化物的主要分解产物,其含量常常反映组织脂质过氧化程度,也间接反映组织受自由基攻击的严重程度。本研究结果表明,BRPS可有效清除·OH,抑制红细胞脂质过氧化作用的发生,保护红细胞膜免受氧化损伤,保护红细胞正常结构和功能,抑制红细胞发生溶血,具有良好的红细胞保护作用。多糖是自然界中含量最丰富的生物多聚物,具有广泛的生物活性.随着绿色革命的到来,开发无污染、低毒性、安全有效的天然绿色药品已经成为一种趋势。草苁蓉作为长白山特有中药具有很高的药用价值和开发前景。