亚洲带绦虫病是一种流行于贵州省都匀地区的危害人类健康的肠道蠕虫病;亚洲带绦虫幼虫寄生于中间宿主猪,引起严重的囊尾蚴病,给养殖业造成巨大的经济损失^〔1〕。因此,对亚洲带绦虫病的研究并控制其流行有重要意义。本研究运用双向电泳、蛋白质印迹结合质谱技术分析亚洲带绦虫囊尾蚴特异性抗原,拟为研制抗亚洲带绦虫囊尾蚴病疫苗、新的治疗药物及诊断抗原提供科学依据。

固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)干胶条(pH 3~10,7 cm)、IPG缓冲液(pH 3~10)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、二硫苏糖醇、硫脲、十二烷基硫酸纳(sodium dodecyl sulfate,SDS),超纯脲、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)、丙基硫酸盐(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate,CHAPS)、碘乙酰胺、蛋白酶抑制剂、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶(美国General Electric公司);低分子量蛋白标准(北京天根生化科技有限公司);辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG (horseradish peroxidase-IgG,HRP-IgG)(北京索来宝生物技术有限公司);聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、化学发光(electro-chemiluminescence,ECL)试剂盒 (武汉博士德生物技术有限公司);其余试剂均为国产分析纯。

亚洲带绦虫成虫采自贵州省都匀市良亩乡布依族村寨亚洲带绦虫病患者(男性,42岁),口服槟榔-南瓜子驱虫^〔2〕,服药后排出1条绦虫,鉴定为亚洲带绦虫成虫。收集孕节虫卵于生理盐水中。取虫卵悬液1 mL进行胆汁孵育试验,用台盼蓝染色计数六钩蚴法^〔3〕检测虫卵存活率为70%。取虫卵悬液0.1 mL,光镜下计数虫卵(重复操作6次,取平均值),计算虫卵总数。用生理盐水稀释虫卵悬液浓度约12万个/mL,其中的存活虫卵数约为8.4万个/mL。

20 d龄三元杂交乳猪6头(贵州大学农学院动物养殖中心),雌雄各半,体重为6.5~7 kg,经粪检和间接血凝实验证实,无亚洲带绦虫囊尾蚴及其他寄生虫感染。将乳猪随机均分为2组,实验组每头猪灌胃1mL虫卵(8.4万个/mL),对照组不感染。2组乳猪均以专用膨化颗粒饲料饲养,隔离圈养于清洁水泥地面饲养宅内,防止自然感染。

家猪感染亚洲带绦虫卵后第20天将2组分别处死,小心剥离实验组家猪肝脏内寄生的囊尾蚴。采集家猪心脏血,分别制备实验组混合血清及对照组混合血清,-80℃保存备用。

参照文献〔4〕。

具体操作参照文献〔4〕。应用SEQUEST统计软件统计参数肽段数及综合得分。根据仪器说明书,肽段数≥3条,综合得分> 30分就可保证结果的可信度。

图 1

注:M: 蛋白标志物; 1 ～ 6: 双向电泳与蛋白质印迹 比对后的对应蛋白斑点。 图 1 亚洲带绦虫囊尾蚴蛋白双向电泳图谱

蛋白斑点数为 (204 ± 11),相对分子质量(molecular weight,Mr)为14 400~ 94 000 kPa,等电点(isoelectric point,pI)为3.0~10.0。其中 (158 ± 7)个蛋白斑点的pI为4.0~7.0,在极酸性(pH=3)和极碱性(pH=10)区域也出现少量蛋白斑点。

图 2

注:1 ～ 6: 蛋白质印迹与双向电泳比对后对应的杂交斑点; A: 实验组混合血清; B: 对照组混合血清。 图 2 亚洲带绦虫囊尾蚴蛋白western blotting 杂交图及阴性对照

实验组特异性抗原抗体杂交斑点为6个,对照组有1个非特异性抗原抗体杂交斑点。经双向电泳图像分析软件分析,初步确定具有抗原性的6种蛋白的pI与相对分子质量比值(pI/Mr)分别为 (3.5/94 000)、(4.5/78 400)、(4.9/66 100)、(4.4/45 000)、 (5.8/23 500)、(5.3/28 300)。

将6个目的蛋白斑点依次进行胶内酶解和串联质谱(mass spectrometry/mass spectrometry,MS/MS)分析鉴定,共鉴定出2个亚洲带绦虫囊尾蚴特异性抗原。从1号抗原蛋白前体离子质荷比为774.50的串联质谱图推测检测到的肽段为TLEDKFFEYEVQ,覆盖NCBI蛋白数据库身份号(ID):124784630序列第218~229位氨基酸。其匹配的肽段数为3条,综合得分为30.11,鉴定为ATP酶管家基因 3-类蛋白2;从3号抗原蛋白前体离子质荷比为719.11及1 140.82的串联质谱图推测检测到的肽段为FTQAGSEVSALLGR及IPSAVGYQPTLATDMGTMQER,覆盖NCBI蛋白数据库身份号(ID):124784488序列第112~125及126-146位氨基酸。其匹配的肽段数分别为4条和1条,综合得分为50.8,鉴定为ATP合成酶β亚基。这2个抗原蛋白与NCBI蛋白数据库中亚洲带绦虫成虫的2种蛋白分别对应。统计参数肽段数及综合得分用SEQUEST统计软件生成。2个蛋白匹配的肽段数均> 3条,综合得分均> 30分,结果可信。另外4个蛋白匹配的肽段数均为零,未能鉴定属何种蛋白。

鉴定寄生虫提取物或蛋白质图谱中的免疫原性蛋白,可用该寄生虫感染的动物宿主血清,也可用特制的超免疫血清作免疫印迹反应^〔5〕。本研究对亚洲带绦虫囊尾蚴特异性抗原进行初步筛查,选用了实验家猪感染混合血清,得到6个特异性抗原抗体杂交斑点,而用阴性对照家猪混合血清仅见1个非特异性抗原抗体杂交斑点。将western blotting检测的6个抗原抗体杂交斑点与原双向电泳凝胶斑点比对,均找到对应蛋白斑点,表明用该法可成功获取抗原蛋白。质谱鉴定出 2个抗原蛋白,分别为ATP酶管家基因3-类蛋白2(ATPase family gene 3-like protein 2)和ATP合成酶β亚基(ATP synthase beta subunit)。前者具有质子转运ATP酶的活性,与 ATP酶的旋转机制有关;后者具有催化ATP合成或水解的活性^〔6〕。本研究western blotting结果显示,亚洲带绦虫囊尾蚴抗原有6个,但质谱仅鉴定出2个抗原蛋白原因可能有:(1)数据库中没有该蛋白的理论序列,无法进行比对,因此检索后不能给出比对结果。(2)样品蛋白与其它分子形成复合物或共价修饰,使肽段产生质量偏移,因此不能在检索中形成质量匹配。(3)其他可能在样品制备过程中的原因。本研究发现的2个特异性抗原的免疫原性还有待进一步研究,以便为研制抗囊尾蚴病疫苗提供参考。