苯(benzene)是一种工业用途广泛的职业有害因素和室内环境污染物,尤其是近年来各种新型建筑材料和装饰材料进入居民住宅和公共建筑,加重了室内空气苯污染。苯是人类致癌物和致突变物,具有致肿瘤和生殖毒性作用,高水平的苯接触可引起不育、流产、畸形、智障等遗传性疾病^〔1〕。苯可导致再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、白血病以及其他血液毒性^{〔2, 3〕}。体内外试验均证实苯能诱导DNA断裂、染色体畸变、DNA加合物的形成、ras基因突变等^{〔4, 5〕}。苯诱导细胞遗传学改变作用机制迄今尚未完全阐明。苯的毒性效应并不在于苯本身,而是其代谢产物,本研究以体外培养人淋巴细胞为模型,在S9(代谢酶CYP2E1)活化状态下,从细胞存活率,周期,凋亡,氧化损伤,DNA链断裂等方面探讨苯及其代谢产物氢醌的细胞毒性作用及其可能的分子机制。

人淋巴细胞分离液(上海试剂二厂);四甲基偶氮唑蓝(美国Solarbio公司);Annexin Ⅴ-FITC+PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司);碘化丙啶、RNA酶(RNAase)、2',7'-二氯乙酰乙酸盐荧光素 (DCHF-DA)、十二烷基肌氨酸钠、低熔点琼脂糖(美国Sigma公司);TritonX-100(上海化学试剂采购供应站分装厂);正常熔点琼脂糖(上海第二生物有限公司);苯、氢醌(上海化学试剂采购分装厂)。EpsonLQ-150k Elx800监测仪(美国 Bio-Tek公司);FACS流式细胞仪(美国BD公司)。

无菌采集5名健康成年男性外周静脉血40 mL,抗凝,加淋巴细胞分离液,常规离心分离人淋巴细胞,取淋巴细胞悬液20μL置于细胞计数板进行计数。将悬液以5 × 10⁵个/mL细胞密度接种于25 mL培养瓶中,3 mL/瓶,然后放置于5% CO₂孵箱中37℃离体培养24 h。

清洗上述培养的人淋巴细胞,分装于细胞培养瓶中,4.5 mL/瓶。分别加入浓度不同的苯与氢醌溶液,使苯终浓度为0.25、3.5、50 μmol/L;氢醌终浓度为50、 150、450 μmol/L。另设磷酸盐缓冲液(PBS)空白对照和乙醇溶剂对照组(体积比为1/1 000),各浓度设置6个平行样。经苯与氢醌染毒的细胞分别培养2 h和24 h后清洗,用0.5 mL磷酸盐缓冲液重悬,台盼蓝检测细胞活力,其存活率> 95%,密度为10⁵~10⁶个/mL。

各组细胞经染毒处理后吸去培养基,换上无血清的RPMI-1640,并加入 MTT 20 μL使其终浓度为500 mg/L,4 h后离心吸弃上清且加 150 μL二甲基亚砜,10 min后于酶标仪570 nm处测定各孔吸光度(A)值,计算细胞存活率(%)=(染毒组A/对照组A) × 100%,实验重复3次。

细胞经4℃预冷后重悬于结合缓冲液中,加入70%的冰冷乙醇10 mL、-20℃固定过夜。取100 μL细胞悬液,加入10 μL碘化丙锭(20 mg/L)溶液和100 mg/L RNA酶结合缓冲液,混匀后置于 37℃水浴箱30 min,再加入400 μL结合缓冲液,流式细胞仪检测细胞周期分布;各样本取100 μL并加入5 μL Annexin2 Ⅴ/FITC和10 μL的碘化丙锭(20 mg/L)溶液,混匀后室温避光孵育15 min,再加入400 μL结合缓冲液,采用流式细胞仪检测并分析细胞凋亡,实验重复3次。

细胞用预冷的PBS洗2遍,吸干后每孔加入10 μmol/L DCFH-DA溶液1 mL放入37℃培养箱作用40 min后,用流式细胞仪 (激发光488 nm,发射光525 nm),测定荧光强度,计数1 × 10⁵个细胞。每个浓度设置3个平行样。

在玻片上铺第1层正常熔点琼脂糖1 mL;第2层为低熔点琼脂糖和细胞悬液混合液150 μL;经过4℃细胞裂解液裂解1 h后,于25 V、300 mA下电泳 20 min。电泳完毕再漂洗2次,自然晾干,用溴化已锭染色10 min,荧光显微镜下观察并用CASP彗星图像分析软件计算彗星细胞发生率(%)和彗星细胞尾长(μm)。

采用SPSS 17.0软件包进行单因素方差分析和t检验,数据以 x ± s表示,检验水准α=0.05。

苯与其代谢产物氢醌对人淋巴细胞的存活率均有明显抑制作用,并在一定程度上呈浓度依赖性。随着苯浓度提高,人淋巴细胞存活率降低,50 μmol/L苯组的人淋巴细胞存活率＜ 40%,与溶剂对照组比较,差异有统计学意义(t=12.65,P ＜ 0.01)。氢醌低、中、高剂量组细胞存活率分别为(76.82 ± 4.95)%、(53.65 ± 6.32)%、(39.41 ± 5.18)%,与空白对照组比较,差异有统计学意义(F=105.37,P ＜ 0.01)。

表 1

表 1 苯对人淋巴细胞周期分布及凋亡影响(x ± s，n = 3)

表 1 苯对人淋巴细胞周期分布及凋亡影响(x ± s，n = 3)

苯作用于人淋巴细胞24 h后,主要诱导S期阻滞,苯低、中、高剂量组S期阻滞率呈剂量-反应关系。G₂/M期细胞数随染毒浓度升高显著增多,而G0/G1期细胞数逐渐减少。与溶剂对照组比较,G₀/G₁期、S期、G2/M期细胞百分率差异均有统计学意义(F=121.37、225.18、30.54,P ＜ 0.05)。苯致人淋巴细胞凋亡率明显增加且呈剂量-反应关系,与溶剂对照组比较,差异有统计学意义(F=239.62,P ＜ 0.01)。

表 2

表 2 氢醌对人淋巴细胞周期分布及凋亡影响(x ± s，n = 3)

表 2 氢醌对人淋巴细胞周期分布及凋亡影响(x ± s，n = 3)

氢醌对人淋巴细胞染毒2 h后,其低、中、高剂量组G₂/M期细胞百分率明显增加,G₀/G₁期细胞数显著减少,与空白对照组比较差异均有统计学意义(F=27.81、106.34,P ＜ 0.05)。低、中、高剂量组间S期细胞百分率差异无统计学意义(F=4.64,P =0.06)。氢醌各浓度组细胞凋亡率亦明显增加且有剂量依赖性,与空白对照组比较,差异有统计学意义(F=9.03,P ＜ 0.01)。

表 3

表 3 苯与氢醌对细胞内ROS 含量及DNA 损伤效应(x± s，n = 3)

表 3 苯与氢醌对细胞内ROS 含量及DNA 损伤效应(x± s，n = 3)

染苯与氢醌各组细胞内ROS水平随染毒浓度增加而升高,呈剂量-效应关系,差异有统计学意义(F=465.71、25.71,P ＜ 0.05)。与溶剂对照组比较,苯低、中、高浓度组细胞的彗星尾长明显增加,差异均有统计学意义(F=43.65,P ＜ 0.01);与空白对照组比较,氢醌低、中、高各剂量组细胞的彗星尾长明显增加,差异均有统计学意义(F=39.28,P ＜ 0.01)。

苯及其代谢物有细胞生长抑制和促进凋亡作用^〔6〕。本研究结果显示,苯与氢醌可诱导人淋巴细胞S+G₂/M期阻滞。G₂/M调控点发生异常,完成DNA复制的细胞不能顺利分裂,可产生癌变。S期阻滞为细胞提供充足时间使受损 DNA得到修复,而当DNA损伤超过细胞耐受极限时,可阻断细胞增殖周期甚至引起凋亡,最终导致死亡。苯的细胞毒性作用机制与凋亡的失衡关系密切。研究证实苯及其代谢物氢醌可诱导HL260细胞和人CD34⁺骨髓细胞剂量依赖性凋亡^{〔7, 8, 9〕}。

苯代谢物通过髓性过氧化酶氧化产生半醌和醌类化合物后氧化还原产生ROS。本研究结果表明淋巴细胞内ROS产生的水平存在剂量效应关系,提示苯及代谢产物进入细胞后可能通过还原反应形成自由基并发生脂质过氧化。ROS作为凋亡信号直接启动细胞内死亡基因的表达或损伤细胞膜或线粒体膜,生成脂质过氧化物的同时诱导DNA、RNA和蛋白质发生交联和氧化,DNA、RNA断裂^{〔10, 11〕},影响细胞正常周期进程,导致正常细胞程序性死亡^{〔12, 13〕},表明苯与氢醌可诱发细胞内ROS升高,其细胞毒性可能与氧化性DNA损伤有关。苯与氢醌是细胞DNA较强断裂剂,可致严重DNA损伤,进而激活DNA修复损伤的能力,DNA损伤与修复间的平衡影响着细胞发展与结局。

苯及其代谢物刺激细胞氧化应激导致过量产生的ROS直接氧化损伤DNA,诱导细胞周期阻滞与程序性死亡。同时半醌和醌类化合物直接激活DNA过度损伤,未修复的DNA诱导染色体损伤和基因突变甚至癌变,引起细胞数目、功能和结构的改变。值得关注的是氧化应激或DNA损伤作用存在着协同效应。